金錢(qián)魚(yú)MHCI類(lèi)基因結(jié)構(gòu)、多態(tài)性與組織表達(dá)分析及其線粒體基因組全序列分析.pdf

1、以金錢(qián)魚(yú)為對(duì)象，利用RACE-PCR技術(shù)，克隆獲得其主要組織相容性復(fù)合體I類(lèi)α基因（Major histocompatibility complex，MHC Iα）和β2m微球蛋白（β2m-microglobulin）基因的全長(zhǎng)序列，并分析其基因結(jié)構(gòu)、組織表達(dá)情況及MHC Iα的多態(tài)性；然后，運(yùn)用間隔PCR法，獲得了金錢(qián)魚(yú)的線粒體基因組全長(zhǎng)序列。這些研究結(jié)果，既為今后探討MHC基因多態(tài)性和抗病性的關(guān)系積累了基礎(chǔ)資料，又豐富了魚(yú)類(lèi)的線粒體

2、基因庫(kù)。論文的主要研究結(jié)果如下：
　　1金錢(qián)魚(yú) MHC Iα基因結(jié)構(gòu)及組織表達(dá)分析
　　運(yùn)用RACE技術(shù)，首次成功克隆獲得長(zhǎng)度為2020bp的金錢(qián)魚(yú)MHC Iα基因的cDNA全長(zhǎng)序列。該基因的開(kāi)放閱讀框（Opening reading frame，ORF）長(zhǎng)1068 bp，編碼一個(gè)分子量為40.09 KDa并由356個(gè)氨基酸組成的前體蛋白，其第1~19位為信號(hào)肽（SP）；5’非編碼區(qū)（5’-Untranslated Regi

3、on，UTR）為86bp；3’UTR為866bp，含有典型的多聚腺苷酸加尾信號(hào)AATAAA及Poly A尾巴。分析表明：該序列含有經(jīng)典的MHC Iα基因結(jié)構(gòu)，如N-糖基化位點(diǎn)、N豆蔻?；稽c(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、cAMP-與cGMP-依賴(lài)的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)和保守的半胱氨酸殘基（C），在第204～278形成一個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)（Immunoglobulin-1ike region，IG-L

4、IKE）。金錢(qián)魚(yú)MHC Iα分子為混合型蛋白，其中α螺旋（H）為23.4％，β片層（E）占28.5%，無(wú)規(guī)卷曲及β轉(zhuǎn)角占48.2%。對(duì)其氨基酸序列分析得知：金錢(qián)魚(yú)MHC Iα基因的與金頭鯛的相似率達(dá)70%，與鱸的相似率為68%，而與鮭鱒類(lèi)、兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳類(lèi)的相似率則依次降低。金錢(qián)魚(yú)MHC Iα基因含有6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子，其內(nèi)含子片段的長(zhǎng)度分別為541bp、335bp、446bp、655bp/691bp、433bp、300bp；內(nèi)

5、含子4在同一個(gè)體中擴(kuò)增出兩種不同長(zhǎng)度類(lèi)型，顯示出長(zhǎng)度多態(tài)性，而內(nèi)含子6卻將3’-UTR區(qū)隔開(kāi)，且所有內(nèi)含子與外顯子進(jìn)行匹配的位點(diǎn)均為gt/ag。用熒光定量PCR法，檢測(cè)金錢(qián)魚(yú)MHC Iα基因在不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，該基因在腎和脾等免疫組織中表達(dá)量較高，中等表達(dá)于胃、肝、心、腦和眼睛，而在鰓、肌肉、腸等組織中的表達(dá)較弱。
　　2金錢(qián)魚(yú)MHC Iα的多態(tài)性
　　從42尾金錢(qián)魚(yú)的210個(gè)有效克隆中，獲得長(zhǎng)度為1065~1

6、074bp的不同核苷酸序列208條，共編碼163條不同的氨基酸序列，這些序列都包含完整的SP，α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域，連接肽、跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)。參照之前的等位基因命名規(guī)則，可歸為20個(gè)等位基因主型及135個(gè)等位基因亞型，分別命名為 Scar-UA*0101~Scar-UA*2001。分析顯示，金錢(qián)魚(yú)MHC Iα基因的核苷酸與氨基酸序列的變異率分別為53.22%、70.22%；其α1和α2結(jié)構(gòu)域的抗原肽結(jié)合區(qū)（PBR）的同義替換率與非同義替

7、換率的比值ω（ω=dN/dS）均大于1，而其非抗原肽結(jié)合區(qū)（non-PBR）、總結(jié)構(gòu)域及α3結(jié)構(gòu)域的ω值都小于1，說(shuō)明α1和α2結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過(guò)程中受到正向選擇作用。運(yùn)用 NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中，金錢(qián)魚(yú)首先與鱸聚為一支，而與虹鱒、金頭鯛、鯉和斑馬魚(yú)的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。
　　3金錢(qián)魚(yú)β2m的基因結(jié)構(gòu)及組織表達(dá)分析
　　金錢(qián)魚(yú)β2m基因的cDNA全長(zhǎng)為905bp，預(yù)測(cè)編碼116個(gè)氨基酸。它的ORF長(zhǎng)351 bp，5’ UTR長(zhǎng)8

8、7bp；3’UTR為467bp，并含有典型的多聚腺苷酸加尾信號(hào)AATAAA及Poly A尾巴。金錢(qián)魚(yú)β2m基因的氨基酸序列的分子量為13.01 kDa，等電點(diǎn)為8.38，信號(hào)肽為第1~15個(gè)氨基酸，而酶切后的成熟蛋白長(zhǎng)101個(gè)氨基酸，含有1個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)、2個(gè)蛋白激酶C-磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸激酶II磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)與主要組織相容性復(fù)合體的信號(hào)識(shí)別位點(diǎn)等不同的功能位點(diǎn)；β2m分子同樣為混合型蛋白，其α螺旋（H）占9.

9、5%，β片層（E）占37.9%，無(wú)規(guī)卷曲及β轉(zhuǎn)角占52.6%。分析顯示，金錢(qián)魚(yú)β2m分子與大黃魚(yú)的相似率高達(dá)78%，與鱸的相似率高達(dá)68%，而與鮭鱒魚(yú)類(lèi)、鯉科魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)的親緣關(guān)系則漸遠(yuǎn)。金錢(qián)魚(yú)β2m基因含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，其內(nèi)含子片段的長(zhǎng)度分別為944bp和279bp，且所有的內(nèi)含子與外顯子進(jìn)行匹配的位點(diǎn)均為gt/ag。采用熒光定量PCR法，對(duì)金錢(qián)魚(yú)β2m基因在十個(gè)正常組織的不同表達(dá)量進(jìn)行定量分析得知：在腎、脾、

10、腸、肝和腦中表達(dá)量很高，中等表達(dá)于心、鰓、胃和眼中，肌肉中表達(dá)量最低。
　　4金錢(qián)魚(yú)的線粒體基因組全序列
　　利用間隔PCR法，擴(kuò)增獲得金錢(qián)魚(yú)的線粒體基因組全序列。該線粒體基因組全長(zhǎng)為16783 bp（GenBank登錄號(hào)：KC790398），為環(huán)狀雙鏈 DNA，主要包括22個(gè)tRNA基因、13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、2個(gè)rRNA基因及1個(gè)非編碼控制區(qū)（D-loop區(qū)）；8個(gè)tRNA和ND6均位于輕鏈，其余基因和D-loop區(qū)則位