鵝MHC classⅠcDNA克隆、基因組結(jié)構(gòu)、等位基因多態(tài)性分析.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex,MHC)指集中于某一染色體、編碼與免疫應(yīng)答直接相關(guān)的一類細(xì)胞膜糖蛋白基因群.其功能不僅限于移植排斥反應(yīng),它還與機體對外源性抗原的免疫應(yīng)答之間存在關(guān)聯(lián).這種發(fā)現(xiàn)引起了人們對MHC研究的濃厚興趣.從DDBJ/EMBL/GenBank基因庫中讀取雞、其它鳥類、兩棲類、爬行類和哺乳類的MHC Ⅰ類基因,進(jìn)行序列分析,在MHC class Ⅰα<,2>鏈兩個半

2、胱氨酸保守區(qū)域的外側(cè)設(shè)計一對簡并引物;使用Trizol試劑盒,提取鵝脾臟總RNA,用RT-PCR方法從鵝的脾臟fcDNA中克隆MHC Ⅰα<,2>鏈部分基因并測序,根據(jù)測序結(jié)果重新設(shè)計一上游引物,使用3'-RACE PCR方法克隆MHCⅠα<,2>到3'一端PolyA序列;再根據(jù)所克隆的MHCⅠα<,2>鏈測序結(jié)果設(shè)計一下游引物,使用eDNA雙鏈合成試劑盒和PCR Library kit試劑盒克隆5'-UT到MHCⅠα<,2>部分序列,

3、然后,將5'和3'一端兩段測序結(jié)果拼接起來,重新設(shè)計一對上下游引物,克隆MHCⅠ的全基因序列.在獲得全基因序列的基礎(chǔ)上,用LA-PCR方法從鵝基因組DNA中克隆了MHC Ⅰ類分子的基因組序列并分析其基因組結(jié)構(gòu).及從另外4羽不同個體鵝的脾臟組織得到fcDNA,使用RT-PCR方法克隆MHCⅠ等位基因全序列,運用生物信息學(xué)技術(shù)對測序結(jié)果進(jìn)行其多態(tài)性分析.最后使用RT-PCR方法檢測了MHCⅠ在鵝不同組織器官中的表達(dá)水平.通過對其基因組結(jié)構(gòu)、

4、等位基因多態(tài)性、多肽結(jié)合區(qū)(PBD)的氨基酸置換率和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行量化分析.結(jié)果顯示Ancy-MHCⅠ成熟蛋白全長348個氨基酸,在α<,1>和α<,2>區(qū)有14個高置換位點.基因組DNA由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成.根據(jù)其遺傳距離可將5個個體的Ancy-MHCⅠ分為3個類型(-UA~-UC).Ancy-MHCⅠ氨基酸序列中保留了HLA-A2與抗原多肽結(jié)合的7個關(guān)鍵性氨基酸.不同等位基因序列同源率為85.1~98.9﹪,鵝與雞的序列同源率