內(nèi)皮素-1引起搔癢的分子機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)最初由豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分離得到的一種活性肽，是目前已知最強(qiáng)的縮血管活物質(zhì)。除內(nèi)皮細(xì)胞外，還發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、白細(xì)胞、心肌細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)能分泌ET-1。ET-1通過兩種G蛋白耦聯(lián)的受體(G-protein-coupled receptor，GPCR)，ETA和ETB受體發(fā)揮作用。ETA受體主要在血管內(nèi)皮、神經(jīng)元及肥大細(xì)胞發(fā)現(xiàn)有表達(dá)，而ETB受體主要

2、在角質(zhì)形成細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等表達(dá)。
　　 辣椒素可引起新鮮分離的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)向電流及細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度上升，ET-1可通過蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)途徑增強(qiáng)DRG神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣對辣椒素的反應(yīng)，辣椒素引起的內(nèi)向電流也明顯增強(qiáng)。動物局部應(yīng)用ET-1出現(xiàn)傷害性行為表現(xiàn)，而人局部應(yīng)用ET-1出現(xiàn)疼痛，近年來發(fā)現(xiàn)人及動物局部應(yīng)

3、用ET-1也出現(xiàn)搔癢。
　　 由同一種物質(zhì)同時(shí)引起疼痛和搔癢，機(jī)體如何處理疼痛和搔癢的信息仍不得而知。ET-1引起搔癢的分子機(jī)制尚不清楚，脊髓中的胃泌素釋放肽受體(Gastrin-releasing peptide receptor， GRPR)是搔癢感受分子，選擇性去除小鼠脊髓Ⅰ層表達(dá)GRPR的神經(jīng)元，動物對所有測試的致癢劑（包含ET-1在內(nèi)）均無反應(yīng)，提示初級神經(jīng)元可能釋放不同的神經(jīng)遞質(zhì)，激活脊髓中痛或者癢特異性感受神經(jīng)元，

4、本文主要研究ET-1引起搔癢分子信號通路。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)動物
　　 實(shí)驗(yàn)選用雄性C57BL/6J小鼠，體重20-25g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，本研究及實(shí)驗(yàn)動物的使用與處理方法得到廣東醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物試驗(yàn)倫理委員會的書面同意，并按照規(guī)定遵守動物福利及盡可能減少使用動物的數(shù)量。
　　 頸背部注射搔癢模型
　　 小鼠于實(shí)驗(yàn)前一天頸背部皮膚剃毛，小鼠于實(shí)驗(yàn)前30min放置于透明的塑料盒子里

5、預(yù)適應(yīng)。應(yīng)用30G針頭進(jìn)行頸背部皮內(nèi)注射，注射藥物后立即放入塑料盒子里面觀察，觀察小鼠用后肢搔抓注射部位次數(shù)，小鼠完成從舉起后肢搔抓注射部位到放下后肢全過程為一次搔抓，觀察30m in。
　　 臉頰部注射行為學(xué)觀察
　　 實(shí)驗(yàn)前一天小鼠臉頰部剃毛，實(shí)驗(yàn)前放置于透明的塑料盒子預(yù)適應(yīng)30min，小鼠從盒子里面取出后用微量注射器（將30G針頭與微量注射器相連）進(jìn)行臉頰部皮內(nèi)注射，注射容量為10μl。注射藥物后立即放入塑料籠子里

6、面觀察，記錄30min內(nèi)動物分別用前肢拂和后肢搔抓注射部位的次數(shù)，用注射側(cè)前肢拂注射部位是疼痛相關(guān)的行為學(xué)表現(xiàn)，用后肢搔抓注射部位是搔癢相關(guān)的行為學(xué)表現(xiàn)。
　　 熱痛覺閾值
　　 熱痛覺閾值測量實(shí)驗(yàn)前一天，小鼠在實(shí)驗(yàn)臺適應(yīng)1h，測定熱痛覺閾值時(shí)，用熱輻射刺激儀照射小鼠足底緊貼玻璃板部位。記錄照射開始至小鼠出現(xiàn)明顯逃避的時(shí)間，調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，使注射藥物前逃避時(shí)間(paw withdraw time，PWT)為(8～12)s。

7、為避免熱損傷，光照時(shí)間不超過20 s。
　　 去TRPV1神經(jīng)元小鼠制作
　　 雄性新生小鼠于出生后第二天七氟醚麻醉后皮下注射辣椒素(50 mg/kg)，對照組注射同樣容量的溶劑(PBS含10％ ethanol與10％ Tween-80)，動物在SPF動物房里面飼養(yǎng)6周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。新生期注射辣椒素能夠去除表達(dá)TRPV1神經(jīng)元，用角膜刺激實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證去除TRPV1神經(jīng)元的效果，用0.01％辣椒素20μl噴到小鼠眼睛上，小鼠會用

8、前肢拂眼睛，記數(shù)1 min內(nèi)用前肢拂眼睛的次數(shù)，如1 min內(nèi)用前肢拂眼睛的次數(shù)少于5次就認(rèn)為已經(jīng)成功去除TRPV1神經(jīng)元。
　　 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)
　　 C57BL/6J小鼠用七氟醚麻醉后背部皮膚消毒，剪下脊柱后快速轉(zhuǎn)移至放置于冰上培養(yǎng)皿內(nèi)，將脊柱泡在冷的L15內(nèi)，無菌狀態(tài)下取出DRG，用0.25％膠原酶Ⅳ于37℃水浴振蕩1h，機(jī)械吹打后用低溫離心機(jī)在下離心(1000rpm)5 min。培養(yǎng)液為含10％胎牛血清

9、的Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)，加入青霉素G鈉鹽和硫酸鏈霉素各10μg/ml，并且加入神經(jīng)生長因子50 ng/ml，細(xì)胞接種于多聚左旋賴氨酸包被的玻片或培養(yǎng)板上，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　 PKCε膜轉(zhuǎn)位
　　 細(xì)胞接種于多聚左旋賴氨酸包被的直徑為10mm玻片上，用0.01 M磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗脫培

10、養(yǎng)液后，加入PBS或ET-1后放入37℃及5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)60 s后吸出上清，用4％PFA固定20 min，漂洗后使用含10％的山羊血清室溫下作用1h，加入第一抗體，分別為兔來源抗PKCε抗體(1∶500)及豚鼠來源的抗TRPV1抗體(1∶3000)，并加入0.2％Triton4℃下孵育16h，漂洗后加入結(jié)合有Alexa Fluor594抗兔IgG和結(jié)合有Alexa Fluor488抗豚鼠IgG的第二抗體孵育2h。用激光共焦顯微鏡(

11、Zeiss，Germany)觀察PKCε膜轉(zhuǎn)位情況。
　　 細(xì)胞內(nèi)cAMP檢測
　　 細(xì)胞接種于多聚左旋賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)板上，倒去培養(yǎng)液，用PBS沖洗后，加入含磷酸二酯酶抑制3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX，2.5 mM)的PBS（含0.1％葡萄糖）在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10 min，吸出培養(yǎng)液，加入含IBMX(2.5 mM)及ET-1(10nM)的PBS（

12、對照組只加入IBMX）繼續(xù)孵育60 s，倒去培養(yǎng)液，每孔加入細(xì)胞裂解液250μl(0.1 M HCl，0.8％ Triton X-100)，室溫下放置10 min，吸出后離心（10000rpm）2 min取上清，上清100μl應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)測量標(biāo)本中cAMP水平，采用小鼠cAMP單克隆抗體ELISA檢測試劑盒檢測。用純化的山羊抗小鼠抗體IgG包被96孔

13、板，制成固相抗體，在實(shí)驗(yàn)前20min準(zhǔn)備好所有試劑及酶聯(lián)板放置于室溫，往包被抗體的96孔板中依次加入cAMP標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、小鼠單克隆cAMP抗體、辣根過氧化物酶（horse-radish peroxidase， HRP）結(jié)合的cAMP，經(jīng)過徹底洗滌后用底物四甲基聯(lián)苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，TMB）顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的cG

14、MP呈正相關(guān)。用在450 nm波長下測定吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度吸光度曲線測量樣品濃度。
　　 另取上清50μl應(yīng)用二喹啉甲酸蛋白質(zhì)試劑盒(bicinchoninic acid protein assay kit，BCA protein assay kit)測量蛋白含量，測量562 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度吸光度曲線計(jì)算樣品蛋白濃度。我們將細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度根據(jù)蛋白含量進(jìn)行校正比較，最終細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度單位表達(dá)為p

15、mol/mg蛋白。
　　 結(jié)果:
　　 1 ET-1通過激活ETA受體引起搔癢
　　 當(dāng)頸背部皮內(nèi)注射100μl濃度為10μM（總量為1000 pmol）的ET-1時(shí)產(chǎn)生明顯的搔抓，30 min內(nèi)小鼠用后肢抓注射部位的次數(shù)達(dá)到360次，依次稀釋10倍發(fā)現(xiàn)頸背部皮內(nèi)注射總量為1 pmol（此時(shí)濃度僅為0.01μM）ET-1仍可引起明顯搔抓，當(dāng)注射總量為100 pmol時(shí)30 min內(nèi)引起搔抓187次，從ET-1引起

16、搔癢的劑量反應(yīng)關(guān)系可以看到這一劑量（1μM，100μl）引起中等程度的搔抓次數(shù)，我們以后的研究中除非特別說明均采用這一劑量的ET-1(1μM，100μl)。
　　 臉頰部注射ET-110μM（容量為10μl）可引起明顯后肢搔抓與前肢拂注射部位，注射ET-11μM引起明顯后肢搔抓，但前肢拂注射部位不明顯，而注射ET-10.1μM不能引起明顯的后肢搔抓與前肢拂注射部位。
　　 特異性ETA受體拮抗劑BQ123及特異性ETB受

17、體拮抗劑BQ788單獨(dú)頸背部皮內(nèi)注射時(shí)并不引起明顯的搔抓反應(yīng)，BQ123100 nmol與100 pmol ET-1共同注射時(shí)可明顯抑制ET-1引起的搔抓，而BQ78830 nmol與100 pmol ET-1共同注射時(shí)可明顯增加ET-1引起的搔抓，說明ET-1通過ETA受體引起搔癢，而ETB受體可能發(fā)揮止癢作用。
　　 2 PKC途徑介導(dǎo)ET-1引起的搔癢
　　 雙吲哚亞酰胺Ⅰ(BisindolylmaleimideⅠ

18、，BIM)是蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)抑制劑，BIM2μg或10μg與ET-1共同注射均能明顯抑制ET-1引起的搔癢，說明ET-1引起的搔癢和PKC途徑有關(guān)。培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元用ET-1(10nM)處理后可見PKC￡主要分布在細(xì)胞膜上，而未用ET-1處理的DRG神經(jīng)元可見PKCε主要分布在細(xì)胞漿內(nèi)。
　　 巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-aceta

19、te，PMA)是常用的PKC激活劑，頸背部皮內(nèi)注射PMA1μM和10μM時(shí)（總量分別為100pmol與1000 pmol）時(shí)引起搔癢，而注射10 pmol時(shí)不引起明顯搔癢。
　　 足底注射PMA與ET-1均能引起熱痛覺過敏，小鼠足底注射PMA100pmol/10μl一直出現(xiàn)抬足等行為，不能測量熱痛覺閾值，10 pmol/10μl引起明顯的熱痛覺過敏，1 pmol/10μl引起的熱痛覺過敏ET-1100 pmol/10μl所引起的

20、熱痛覺過敏相當(dāng)，足底注射1μg BIM15 min后可以完全抑制同一部位注射ET-1和PMA引起的熱痛覺過敏。
　　 3 cAMP-PKC途徑介導(dǎo)ET-1引起的搔癢
　　 由磷酯酶C(phospholipase C，PLC)激活PKC是PKC激活的經(jīng)典通路，我們應(yīng)用PLC阻滯劑U73122觀察PLC通路的作用。頸背部注射U73122(10 pmol，100μl)不引起明顯搔抓及其他異常表現(xiàn)，但與預(yù)期結(jié)果相反，U73122

21、(100 pmol)與ET-1共同注射明顯增加ET-1引起的搔抓次數(shù)。提示可能由非經(jīng)典通路環(huán)單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)激活PKC從而介導(dǎo)ET-1引起的搔癢。
　　 ET-1(10nM)刺激培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元60 s后，應(yīng)用cAMP單克隆抗體ELISA法測量細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的變化，ET-1處理神經(jīng)元后明顯增加細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度。直接應(yīng)用腺苷酸環(huán)化酶(Adenylyl cy

22、clase，AC)抑制劑SQ22536對ET-1引起搔癢的作用。SQ22536與ET-1共同注射可劑量依賴性地抑制ET-1引起的搔癢。AC激活后引起細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高，cAMP濃度升高引起蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)激活，PKA阻滯劑H89與ET-1共同皮內(nèi)注射對ET-1引起的搔癢無明顯作用。
　　 為了排除U73122的非特異性作用，我們研究了更高濃度的U73122對ET-1及復(fù)合物48/80(c

23、ompound48/80，C48/80)引起搔癢的影響。C48/80可刺激培養(yǎng)的肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺，U73122(10μM)可明顯抑制肥大細(xì)胞的脫顆粒。C48/80皮內(nèi)注射可引起明顯的搔癢，與U73122(1000 pmol)共同注射后引起的搔癢可明顯減輕，而U73122(1000 pmol)仍然增加ET-1引起的搔癢。皮內(nèi)注射phosphatidylcholine specific phospholipase C（磷脂酰膽堿磷酯酶

24、C，PC-PLC）抑制劑D609，15 min再在同一部位注射ET-1或者C48/80，D609可抑制ET-1引起的搔癢，而D對C48/80引起的搔癢無明顯影響。
　　 4 TRPV1、H1R、TRP、TRPA1在ET-1引起搔癢中的作用
　　 腹腔注射TRPV1拮抗劑辣椒平(4 mg/kg)或者H1R拮抗劑美吡拉敏(mepyramine，40 mg/kg)對ET-1引起的搔癢無明顯影響。新生期注射辣椒素后能去除TRPV

25、1神經(jīng)元，ET-1在新生期注射辣椒素成年動物不引起明顯搔癢，而對照組成年動物對ET-1引起的搔癢反應(yīng)無明顯影響。非選擇性TRP抑制劑釕紅(ruthenium red，RR，5 nmol)共同注射可增加ET-1引起的搔癢，但同樣劑量的RR抑制組胺引起的搔癢。TRPA1拮抗劑AP18(100 nmol)共同注射可增加ET-1引起的搔癢，同樣劑量的AP18對組胺引起的搔癢無明顯作用。ET-1引起的疼痛可能與TRPA1有關(guān)，RR與AP18增加E

26、T-1引起的搔癢可能與其減少疼痛有關(guān)。在皮內(nèi)注射ET-1前15 min皮下注射嗎啡(5 mg/kg)，嗎啡對ET-1引起的搔癢無明顯影響，提示ET-1引起的搔癢與疼痛無關(guān)。
　　 5 ETB受體的止癢作用
　　 皮下注射納洛酮0.5mg/kg可明顯抑制15min后皮內(nèi)注射ET-1所引起的搔癢，而小劑量的納洛酮(2 nmol)皮下注射對ET-1引起的搔癢無明顯影響，當(dāng)納洛酮與ET-1共同一起皮內(nèi)注射時(shí)，兩種劑量的納洛酮(2

27、nmol與0.5mg/kg)均明顯增加ET-1引起的搔癢，這種作用與納洛酮的全身作用無關(guān)，因?yàn)槿響?yīng)用納洛酮的效果與此相反或者在小劑量的時(shí)候無明顯效果。
　　 外周存在μ、κ、δ三種阿片類受體亞型，我們應(yīng)用選擇性亞型拮抗劑來觀察各亞型的作用，大劑量KOR拮抗劑Nor-BNI（超過15nmol/50μl時(shí)）頸背部皮內(nèi)注射時(shí)可引起搔癢，而5nmol/50μl時(shí)不引起明顯搔癢，我們選擇了這一劑量進(jìn)行研究，其他的劑量參考以前的研究，MO

28、R拮抗劑CTOP或DOR拮抗劑naltrindole一起注射對ET-1引起的搔癢無明顯影響，而Nor-BNI明顯增加ET-1引起的搔癢，可見外周KOR介導(dǎo)了ETB受體的止癢作用。
　　 KOR激動劑的抗傷害作用與一氧化氮有關(guān)，一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase)有內(nèi)皮型(endothelia)、神經(jīng)型(neuronal)和誘導(dǎo)型(inducible)三種亞型，nNOS抑抑劑可拮抗KOR激動劑的止痛作用。應(yīng)用非

29、選擇性NOS抑制劑發(fā)現(xiàn)L-NAME(200 nmol)明顯增加ET-1引起的搔癢，而D-NAME對ET-1引起的搔癢無明顯影響。NOS有三種亞型分別為內(nèi)皮型、神經(jīng)型、誘導(dǎo)型，應(yīng)用特異的選擇性亞型抑制劑與ET-1共同注射，eNOS抑制劑(L-NIO，200 nmol)可明顯增加ET-1引起的搔癢，而誘導(dǎo)型iNOS抑制劑(AMT,5nmol)、神經(jīng)型nNOS亞型抑制劑(Nω-Propyl-L-arginine，20 nmol)對ET-1引起

30、的搔癢無明顯作用。由于神經(jīng)元中主要存在nNOS，角質(zhì)形成細(xì)胞中主要存在eNOS，eNOS抑制劑也能增加ET-1引起的搔癢說明KOR激動劑可能通過角質(zhì)形成細(xì)胞起作用。
　　 結(jié)論:
　　 1 ET-1通過ETA/AC/PKC途徑引起搔癢。
　　 2由cAMP激活PKC是非經(jīng)典途徑，這個通路通過Epac(exchange proteinsactivated directly by cyclic AMP，cAMP直接激

31、活的交換蛋白)激活下游PLC與PLD，在體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)從cAMP激活PKC離不開PLC與PLD的作用，本研究中PLC抑制劑U73122與預(yù)期相反的作用，說明ET-1引起搔癢的cAMP激活PKC通路與以前發(fā)現(xiàn)的通路不同，我們發(fā)現(xiàn)了一個全新的由cAMP激活PKC通路，該通路可能與PC-PLC通路有關(guān)。
　　 3 ETB受體發(fā)揮止癢作用，外周阿片類受體κ亞型通過eNOS介導(dǎo)這一止癢作用，角質(zhì)形成細(xì)胞釋放的NO也可能發(fā)揮止癢作用。