類泛素分子Urm1修飾相關蛋白及大腸桿菌ExoI蛋白的結構與功能研究.pdf

1、泛素分子(UB)和類泛素分子(UBLs)是一些小分子量蛋白，通過共價連接到蛋白質底物上，涉及一系列重要的胞內生理進程。真核生物中的Urm1是最古老的類泛紊分子，在酵母中起到很多非常重要的作用，如抗氧化能力，對環(huán)境的耐受性和繁殖出芽等等。Urm1修飾系統(tǒng)在胞內涉及轉硫作用（tRNA修飾）和蛋白類泛素修飾兩方面，被認為是進化過程中的分子化石，是連接原核的轉硫系統(tǒng)和真核的泛素家族的進化分支點。Urm1系統(tǒng)中的Tum1蛋白是其中的重要組分，負責

2、絕大部分的Nfs1至Uba4的轉硫作用。
　　本研究成功建立了酵母Urm1系統(tǒng)相關蛋白的原核表達純化系統(tǒng)，并采用氣相懸滴擴散法在20℃條件下培養(yǎng)出Tum1蛋白晶體，收集和分析了該晶體的X-射線衍射數據，衍射分辨率為1.9(A)。Tum1晶體的空間群屬于I41晶系，其晶胞參數為a=b=120.94(A)，c=48.35(A)，α=β=γ=90°。以人類3-巰基丙酮酸硫基轉移酶(PDB ID:3OLH)的晶體結構為模型，采用分子置換法

3、解析出Tum1的晶體結構。酵母Tum1晶體結構總體呈橢球狀，擁有11個α螺旋和7個β折疊，大體上等分成兩塊，分屬兩個RLD結構域(rhodanese-like domain)。兩塊之間形成一個溝型地帶，活性位點Cys259殘基處于溝底。通過對Tum1晶體結構的分析，發(fā)現其活性位點Cys259被過硫化修飾，且活性位點附近有未知的配體小分子存在。通過實驗排除了配體小分子為羥脯氨酸的可能性。
　　大腸桿菌外切核酸酶1(Exol)是一種只

4、從單鏈DNA的3'端往5'端進行持續(xù)水解的外切脫氧核糖核酸酶。Exol參與多種染色體的損傷修復和重組過程，如DNA上脫嘌呤和脫嘧啶位點的修復，氧化傷害導致的3'端磷酸羥乙酸基的去除，甲基指向的DNA鏈錯配修復，以及抑制移碼突變等等。
　　本研究成功克隆純化了大腸桿菌Exol蛋白，并采用氣相懸滴擴散法和氣相坐滴擴散法在20℃條件下培養(yǎng)出Exol和3'端磷酸化修飾的單鏈DNA(12A-3'PHO)共結晶，Exol和dTTP共結晶以及活

5、性抑制態(tài)Exol等若干結晶。成功收集了活性抑制態(tài)Exol結晶的X-射線衍射數據，衍射分辨率2.5(A)。此Exol晶體的空間群屬于P212121晶系，其晶胞參數為a=67.25(A),b=126.64(A)，c=141.25(A)，α=β=γ=90°。以已有的Exol晶體結構(PDB ID:1FXX，2QXF，3C94，3C95，3HL8，3HP9)為模型，采用分子置換法解析出活性抑制態(tài)Exol晶體結構，發(fā)現該晶體結構中不含Mg2+離子

6、，每個不對稱單位中含有兩個Exol蛋白分子。通過體外活性實驗確定Mg2+離子缺失對Exol活性的完全抑制作用，和單鏈DNA3'端磷酸化修飾對Exol活性的不完全抑制作用，并且發(fā)現DNA的3'端自由羥基并非Exol活性所必須。在以上實驗結果的基礎上，提出Exol活性抑制的位阻效應假說。
　　本論文主要對Tum1和Exol的晶體結構和生物學功能進行了研究。通過晶體X衍射法，我們首次得到并解析了Tum1和活性抑制態(tài)Exol的晶體結構。通