類泛素修飾蛋白Saccharomyces cerevisae Urm1的溶液結(jié)構(gòu)測(cè)定、進(jìn)化意義分析及功能研究.pdf

1、本論文的工作重點(diǎn)包括S.cerevisiae Urml蛋白的克隆、表達(dá)純化并用核磁共振的方法解析了溶液中Urml蛋白的結(jié)構(gòu)?；诮Y(jié)構(gòu)，我們分析研究了修飾蛋白與載硫蛋白的進(jìn)化關(guān)系以及Urml修飾體系中Urml與它的活化酶Uba4的相互作用模式。我們作了整個(gè)泛素超家族蛋白的結(jié)構(gòu)比較和結(jié)構(gòu)聯(lián)配的序列比對(duì)。進(jìn)化分析顯示，Urml是泛素超家族的分子化石，它的結(jié)構(gòu)和序列可能最好的保守了這個(gè)超家族共同祖先蛋白質(zhì)的特征。我們還推測(cè)了Urml與Uba4的

2、作用界面。另外，我們還采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法來分析Urml修飾體系的靶蛋白。 第一章是蛋白質(zhì)修飾體系的簡(jiǎn)介，介紹了蛋白質(zhì)修飾體系的分類和生物學(xué)功能。目前已發(fā)現(xiàn)的修飾體系有11類，包括：Ubiquitin、NEDDS/Rubl、SUMO、ISG15/UCRP、FAT10、FUB1、UBL5/Hub1、Atg8 and Atg12、Ufm1和Urm1修飾體系。本章重點(diǎn)介紹了Urml修飾體系的研究背景。Urml修飾體系自2000年首次

3、被報(bào)道，現(xiàn)在已得到越來越多的關(guān)注。已經(jīng)有報(bào)道Urml修飾體系在酵母的出芽生殖、營(yíng)養(yǎng)缺陷時(shí)的侵染性生長(zhǎng)的形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮功能、參與TOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑下游通路的調(diào)控和氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控。但是目前關(guān)于Urml修飾體系功能的研究還主要是通過缺失基因觀察表型，更具體的作用機(jī)理和可能還有待進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。本章還介紹了關(guān)于修飾蛋白進(jìn)化起源的研究。 第二章介紹了分子進(jìn)化研究的基本理論和研究方法。分子進(jìn)化鐘與中性理論是分子進(jìn)化研究的基礎(chǔ)。構(gòu)建

4、進(jìn)化樹是研究分子進(jìn)化的主要手段。構(gòu)建序列進(jìn)化樹的步驟包括：1．序列比對(duì)建立數(shù)據(jù)模型。2．決定取代模型。3．選擇建樹方法。4．進(jìn)化樹搜索。5．確定樹根。6．進(jìn)化樹評(píng)估。我們還介紹了蛋白質(zhì)進(jìn)化的基本特點(diǎn)和蛋白質(zhì)進(jìn)化關(guān)系的識(shí)別。 第三章中我們解析了S.cerevisae Urml蛋白的溶液結(jié)構(gòu)，并分析了其進(jìn)化意義。從Saccharomyces cerevisae(S288C)菌株染色體中獲取編碼Urml蛋白的基因，構(gòu)建表達(dá)菌株，經(jīng)純

5、化以及同位素標(biāo)記的預(yù)處理，通過核磁共振技術(shù)，在計(jì)算機(jī)軟件輔助下，計(jì)算出S. cerevisae Urml蛋白在水溶液中的結(jié)構(gòu)。Urml的空間結(jié)構(gòu)是由一個(gè)含有五段β-strand的β-sheet和四段α螺旋折疊而成。β-strand以21534的順序組裝成β-sheet曲面。四段螺旋在空間上相互靠近，將β-sheet曲面的凹面封閉，形成一個(gè)疏水的核心，包裝成緊湊的球形結(jié)構(gòu)。α2螺旋內(nèi)側(cè)疏水殘基與β-sheet凹面疏水殘基的疏水相互作用是維

6、持此球形結(jié)構(gòu)域的主要作用力。α1和α3在空間上相互靠近，可以檢測(cè)到它們的遠(yuǎn)程N(yùn)OE。緊隨β4 strand后的四個(gè)殘基折疊成小螺旋α4，可以觀察到α2螺旋N末端前的殘基(33-35)與α4螺旋C末端后的幾個(gè)殘基(80-83)間的遠(yuǎn)程N(yùn)OE。Urml在C末端的六個(gè)殘基構(gòu)成柔性的尾巴從球形結(jié)構(gòu)域伸出。結(jié)構(gòu)相似性比較分析顯示，Urml與ThiS，MoaD的結(jié)構(gòu)相似程度更高于它與其它修飾蛋白的結(jié)構(gòu)相似性。Urml的表面靜電，疏水特性也與MoaD

7、的分子表面特征相似，意味著它們可能以相似的方式與配體蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)比較的結(jié)果共同支持了修飾蛋白質(zhì)由古老載硫蛋白進(jìn)化產(chǎn)生的推測(cè)，同時(shí)為Urml是泛素超家族中的‘分子化石’，即Urml最好的保守了泛素超家族的共有祖先的分子特性的推測(cè)提供了重要的證據(jù)。另外，分子表面性質(zhì)分析提示，類似MoaD，Urml通過一個(gè)暴露的疏水平臺(tái)和平臺(tái)周圍一些帶電殘基與配體發(fā)生相互作用。我們相信Urml蛋白結(jié)構(gòu)的解析為揭示泛素超家族蛋白質(zhì)進(jìn)化起源

8、提供了重要證據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究修飾蛋白質(zhì)的生理功能和修飾機(jī)理提供了新的信息。第四章介紹了我們用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究Urml修飾體系靶蛋白的工作進(jìn)展。首先綜述介紹了蛋白質(zhì)組學(xué)概念和研究策略，以及用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析修飾蛋白體系靶蛋白的策略和研究進(jìn)展。我們希望通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析鑒定Urml修飾體系的潛在的靶蛋白，幫助我們更深入的了解Urml修飾體系的生理功能、作用機(jī)理。目前我們已經(jīng)成功構(gòu)建了HisX60-Urml的酵母誘導(dǎo)表達(dá)菌株，并