小類泛素修飾蛋白家族成員在腦缺血后的活化及其神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：小類泛素修飾蛋白或稱小泛素相關(guān)修飾物（Small Ubiquitin-like Modifier Protein，SUMOs）家族是一類新近發(fā)現(xiàn)的泛素樣分子物質(zhì)，是一類結(jié)構(gòu)與泛素蛋白家族類似但功能迥異的小分子蛋白，它們也參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，但是不參與靶蛋白的蛋白酶體降解，而是通過與靶蛋白中的特定賴氨酸殘基共價連接來可逆性修飾靶蛋白，廣泛參與靶蛋白的功能調(diào)節(jié)及定位過程。在與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，SUMOs通過與靶蛋

2、白(如轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄輔助因子)的共價結(jié)合發(fā)揮對損傷細(xì)胞的修復(fù)作用。腦缺血早期常誘導(dǎo)明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，因此我們推測在缺血性腦血管病發(fā)生后，特別是急性應(yīng)激期可能存在大量SUMOs家族成員的活化，并可能通過與靶蛋白的共價結(jié)合提高缺血耐受而發(fā)揮特定的神經(jīng)元保護(hù)作用。總體來說，增強(qiáng)的蛋白質(zhì)SUMO化極可能代表細(xì)胞保護(hù)性反應(yīng)。本研究的目的即通過體內(nèi)、外（在體、離體）實驗?zāi)Ｐ蜋z測SUMOs家族成員在缺血性腦血管病發(fā)生后的活化情況、結(jié)合蛋白的亞細(xì)胞定

3、位及其是否具有一定的神經(jīng)保護(hù)功能，為未來神經(jīng)保護(hù)性藥物的研發(fā)提供理論及證據(jù)支持、可能的治療靶點和方法借鑒。
　　方法：1、原代分離培養(yǎng)新生24小時Sprague-Dawley（SD）乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光方法鑒定神經(jīng)元純度；2、建立氧/糖剝奪（OGD）神經(jīng)元模型，應(yīng)用原位細(xì)胞凋亡方法檢測細(xì)胞凋亡數(shù)量；3、應(yīng)用Western Blot方法檢測SUMO-1和SUMO-2/3的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光雙染方法檢測SUM

4、O-1和SUMO-2/3的蛋白定位變化；4、利用神經(jīng)元特異性SUMOs基因敲除小鼠建立大腦中動脈梗死（MCAO）模型，比較SUMOs基因敲除MCAO小鼠和野生型 MCAO小鼠的動物神經(jīng)功能評分；5、解剖小鼠腦組織，切片后比較梗死體積。原位凋亡法（TUNEL）檢測海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況。
　　結(jié)果：1、利用原代貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法成功獲得大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光方法鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞高表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白——神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和

5、微管相關(guān)蛋白-2（MAP-2），不表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白——膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP），神經(jīng)元純度大于96％；2、原位細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示OGD神經(jīng)元發(fā)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞數(shù)量明顯多于正常對照細(xì)胞（P<0.01）；3、Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn) OGD神經(jīng)元中 SUMO-2/3的蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯上升（P<0.01），但 SUMO-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05）。細(xì)胞免疫熒光實驗結(jié)果顯示OGD神經(jīng)元中發(fā)生了SUMO-

6、2/3蛋白由細(xì)胞漿向細(xì)胞核的移位現(xiàn)象（核聚集）；4、MCAO動物模型實驗結(jié)果顯示神經(jīng)元特異性 SUMO-1～3基因敲除小鼠接受MCAO處理后，其動物神經(jīng)功能評分在造模后6d、11d、16d均明顯劣于接受 MCAO處理的野生型小鼠（P<0.01）；5、神經(jīng)元特異性SUMO-1～3基因敲除小鼠在接受相同 MCAO手術(shù)處理后腦梗死體積明顯大于野生型小鼠（P<0.01）；其海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡百分率明顯高于野生型小鼠（P<0.01）。