神經(jīng)元IRAK1-4及腦缺血預(yù)適應(yīng)后小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用機(jī)制研究.pdf

1、缺血性腦卒中是世界上常見的致死致殘?jiān)?其繼發(fā)的腦缺血缺氧性損傷是一個(gè)涉及多種機(jī)制、多個(gè)階段、多種神經(jīng)細(xì)胞相互作用的過程,主要包括興奮性氨基酸毒性、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡這三個(gè)方面,各種機(jī)制在腦缺血缺氧的各個(gè)時(shí)期分別或協(xié)同發(fā)揮作用。其中,損傷效應(yīng)持續(xù)數(shù)小時(shí)~數(shù)周的炎癥機(jī)制成為缺血性腦卒中治療的合理切入點(diǎn)。在缺血缺氧性損傷導(dǎo)致的炎癥病理過程中,神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞均被證明在缺血性腦卒中啟動的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。其中,神經(jīng)元是神經(jīng)功能損害的直

2、接原因,而小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)常駐的巨噬細(xì)胞,是腦內(nèi)炎癥反應(yīng)主要的發(fā)動者和參與者。既往研究認(rèn)為缺血性腦卒中引發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化是導(dǎo)致神經(jīng)元繼發(fā)性損傷的重要原因。最新研究證實(shí),神經(jīng)元內(nèi)自身炎癥信號通路激活在急性腦缺血缺氧性損傷早期發(fā)揮重要作用,且此作用的發(fā)揮并不依賴于梗塞區(qū)域皮層小膠質(zhì)細(xì)胞活化,小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血過程中活化滯后,主要在繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮作用。針對上述兩種神經(jīng)細(xì)胞在缺血性腦卒中誘導(dǎo)的急性缺血缺氧性腦損傷中不同的活化時(shí)效特點(diǎn),

3、本課題緊緊圍繞缺血性腦卒中后急性缺血缺氧性腦損傷早期腦保護(hù)這個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問題,分別從神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞角度,系統(tǒng)提出了兩種干預(yù)及保護(hù)機(jī)制:
　　1.神經(jīng)元IRAK-1/4抑制:Toll樣受體(Toll Like Receptors, TLRs)是體內(nèi)重要的模式識別受體(Pattern Recognition Receptor, PRR),在多種感染性疾病及神經(jīng)退行性病變發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。近年來, TLR-2/4已被證實(shí)在腦內(nèi)

4、廣泛表達(dá),神經(jīng)元TLR-2/4基因敲除可顯著減輕急性腦缺血缺氧引起的神經(jīng)功能缺陷、縮小梗塞灶體積。白介素-1受體相關(guān)激酶-1/4(Interleukin-1 Receptor-Associated Kinases,IRAKs)是 TLRs通路下游關(guān)鍵的調(diào)控因子。目前,已有多方面證據(jù)提示 IRAK-1/4對TLRs通路調(diào)控具有關(guān)鍵作用:首先,IRAK1被IRAK4磷酸化是TLRs通路髓樣分化因子88(Myeloid Differentia

5、tion factor88, MyD88)依賴途徑最早的活化環(huán)節(jié),與早期受體復(fù)合物的形成和下游信號分子的激活關(guān)系密切。其次,IRAK4基因敲除小鼠TLRs通路下游細(xì)胞因子嚴(yán)重缺失,IRAK4基因缺失/突變的患者對外源性 MyD88依賴的TLRs配體反應(yīng)嚴(yán)重減低。但目前對于TLRs在缺血性腦損傷研究尚局限于 TLRs本身及通路下游炎性細(xì)胞因子,而對處于 TLRs通路關(guān)鍵調(diào)控地位的 IRAKs研究還停留在外周細(xì)胞水平,IRAK-1/4在腦內(nèi)

6、缺血引起的炎癥啟動及信號轉(zhuǎn)遞中的調(diào)控作用尚無相關(guān)報(bào)道。據(jù)此,本課題提出通過抑制腦缺血后神經(jīng)元 IRAK-1/4活化,可以調(diào)控神經(jīng)元TLR-2/4受體下游炎癥因子釋放,抑制過度炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的假設(shè)。
　　2.小膠質(zhì)細(xì)胞預(yù)活化:腦缺血預(yù)適應(yīng)(Cerebral Ischemic Preconditioning, CIP)是指短暫的腦缺血(預(yù)處理)可減輕隨后嚴(yán)重、長時(shí)間腦缺血導(dǎo)致的腦損傷,已被證實(shí)可在缺血性腦卒中發(fā)揮明確的

7、保護(hù)作用。因此,揭示腦缺血預(yù)適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制并予以利用,對缺血性腦卒中防治研究具有重大意義。但是,腦缺血預(yù)適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制非常復(fù)雜,目前仍未闡明,尤其是腦內(nèi)免疫功能的主要執(zhí)行者――小膠質(zhì)細(xì)胞在此過程中發(fā)揮怎樣的作用目前尚缺乏研究?，F(xiàn)已證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血過程中活化滯后,并未直接參加缺血性腦卒中后急性缺血缺氧導(dǎo)致的早期炎癥反應(yīng)。我們的前期工作及相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腦缺血預(yù)適應(yīng)可使小膠質(zhì)細(xì)胞活化過程提前,且其活化部位與腦缺血預(yù)適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)區(qū)

8、域顯著相關(guān)。據(jù)此,本課題提出通過腦缺血預(yù)適應(yīng)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的假設(shè)。
　　一、神經(jīng)元IRAK1/4抑制在大鼠缺血性腦損傷早期中的作用及機(jī)制研究
　　目的
　　明確腦缺血/缺氧早期神經(jīng)元IRAK-1/4表達(dá)變化與神經(jīng)損傷的關(guān)系,探討神經(jīng)元IRAK-1/4抑制在腦缺血/缺氧性損傷中的作用及機(jī)制。
　　方法
　　整個(gè)研究包括在體和離體實(shí)驗(yàn)。
　　1.頸內(nèi)動脈線栓法建立SD大鼠大腦中動脈梗塞

9、(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)模型;
　　2.將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分成正常對照組(Control group)、假手術(shù)組(Sham surgery group)、缺血組(Vehicle group)和干預(yù)組(Treatment group);
　　3.應(yīng)用免疫熒光、RT-PCR、Western blot方法測定各組缺血性腦卒中后3、6、12、24 h腦內(nèi)神經(jīng)元 IRAK-1/4表達(dá)

10、變化;
　　4.測定各組7 d生存率、神經(jīng)功能評分、梗塞體積,評價(jià)IRAK-1/4 inhibitor對缺血性腦卒中早期腦損傷作用;
　　5.建立二氯化鈷(Cobalt Chloride, CoCl2)誘導(dǎo)的 B35神經(jīng)元樣細(xì)胞化學(xué)性缺氧損傷模型;
　　6.應(yīng)用免疫熒光、RT-PCR、Western blot方法測定各組化學(xué)缺氧1、3、6、12、24 h后B35細(xì)胞內(nèi)IRAK-1/4表達(dá)變化;
　　7. CCK8

11、、免疫熒光、流式細(xì)胞法檢評價(jià)IRAK-1/4 inhibitor對B35化學(xué)缺氧損傷的作用;
　　8.免疫熒光、ELISA、Western blot法檢測各組IRAK-1/4 inhibitor對B35細(xì)胞TLRs信號通路分子影響:(1)NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位(2)TNF-α、IL-6分泌變化(3)T-JNK、p-JNK及c-Casepase3表達(dá)變化。
　　結(jié)果
　　在體實(shí)驗(yàn)
　　1.腦皮層神經(jīng)元表達(dá) I

12、RAK-1和-4,其表達(dá)變化參與MCAO誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元急性缺血缺氧性損傷病理過程。
　　2.神經(jīng)元 IRAK-1/4抑制可減輕 MCAO誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元急性缺血缺氧性損害,包括縮小梗塞體積,減輕神經(jīng)功能損害,提高生存率。
　　離體實(shí)驗(yàn)
　　1. B35表達(dá) IRAK-1和-4,其表達(dá)變化參與CoCl2誘導(dǎo)的B35化學(xué)缺氧性損傷病理過程。
　　2. IRAK-1/4抑制可減輕CoCl2誘導(dǎo)的B35細(xì)胞毒性損傷。<

13、br>　　3. IRAK-1/4抑制可減輕CoCl2誘導(dǎo)的B35凋亡損傷。
　　4. IRAK-1/4抑制的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與抑制 B35 TLRs通路下游 NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位,減少炎癥因子 TNF-α、IL-6分泌有關(guān)。
　　5. IRAK-1/4抑制的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與抑制B35 TLRs通路下游JNK磷酸化,并減少 c-Caspase3產(chǎn)生有關(guān)。
　　結(jié)論
　　神經(jīng)元IRAK-1和-4參與

14、缺血性腦卒中后急性缺血/缺氧腦損傷病理過程,神經(jīng)元IRAK-1/4抑制能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,其作用機(jī)制與抑制神經(jīng)元自身TLRs信號通路下游 NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位及 JNK磷酸化,并最終降低促炎因子 TNF-α、IL-6及促凋亡c-caspase3產(chǎn)生有關(guān)。因此,IRAK-1/4抑制可能是減輕缺血性腦卒中誘導(dǎo)的急性缺血缺氧性損傷的新的重要策略。
　　二、小膠質(zhì)細(xì)胞活化參與腦缺血預(yù)適應(yīng)神經(jīng)保護(hù)的作用及機(jī)制研究
　　目的<

15、br>　　研究腦缺血預(yù)適應(yīng)調(diào)控的小膠質(zhì)細(xì)胞活化特點(diǎn)及其與腦缺血預(yù)適應(yīng)神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)系,并從小膠質(zhì)細(xì)胞免疫分型 M1/M2變化角度探討腦缺血預(yù)適應(yīng)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法
　　整個(gè)研究包括在體和離體實(shí)驗(yàn)。
　　1.應(yīng)用頸內(nèi)動脈線栓法建立 SD大鼠 MCAO/短暫性 MCAO(transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO)模擬的缺血性腦卒中/C

16、IP模型;
　　2.將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分成正常對照組(Control group)、假手術(shù)組(Sham surgery group)、缺血組(Vehicle group)、預(yù)適應(yīng)組(Preconditioning group)和干預(yù)組(Treatment group);
　　3.測定各組3 d生存率、神經(jīng)功能評分、梗塞體積,評價(jià)CIP及CIP聯(lián)合米諾環(huán)素對缺血性腦卒中早期腦損傷作用;
　　4.應(yīng)用免疫熒光測定各組 MCAO

17、后1、12、24 h缺血皮層小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及活化情況;
　　5.使用RT-PCR方法檢測各組 MCAO后12 h缺血皮層M1(CD16、CD32、iNOS)/M2(TGF-beta、Ym1/2)mRNA表達(dá)情況;
　　6.應(yīng)用原位雜交檢測腦缺血預(yù)適應(yīng)對大鼠缺血區(qū)域周邊皮層炎癥細(xì)胞因子表達(dá)影響;
　　7.建立氧糖剝離(Oxygen Glucose Deprivation, OGD)/短暫性氧糖剝離(transient O

18、xygen Glucose Deprivation, tOGD)誘導(dǎo)的缺血/缺血預(yù)適應(yīng)模型;
　　8. CCK8、LDH法檢評價(jià)tOGD及tOGD聯(lián)合米諾環(huán)素對PC12+BV2共培養(yǎng)OGD24 h損傷的作用;
　　9.應(yīng)用免疫熒光檢測各組 MCAO后12 h缺血皮層及 OGD后2 h小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b表達(dá)情況;
　　10. Realtime-PCR等方法測定各組OGD后1、6、12、24 h后BV2細(xì)胞內(nèi)M1(CD3

19、2、iNOS、CD86)/M2(CD206、IL-10、CCL-22)表達(dá)變化。
　　結(jié)果
　　在體實(shí)驗(yàn)
　　1. tMCAO可減輕MCAO誘導(dǎo)的大鼠急性缺血缺氧性腦損害,包括縮小梗塞體積,減輕神經(jīng)功能損害,提高生存率;使用米諾環(huán)素對 tMCAO調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化過程進(jìn)行抑制,能顯著降低tMCAO神經(jīng)保護(hù)作用。
　　2. tMCAO可調(diào)控MCAO誘導(dǎo)的局灶性腦缺血皮層小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多,活化過程提前;
　　

20、3. tMCAO抑制缺血皮層在MCAO12 h表達(dá)M1(CD11b)標(biāo)記物,調(diào)控M1(CD32、iNOS、CD86)/M2(CD206、IL-10、CCL-22)mRNA表達(dá);
　　4. tMCAO促使腦內(nèi)IκB-α在MCAO早期升高,并始終維持TNF-α表達(dá)在較低水平有關(guān)。
　　體外實(shí)驗(yàn)
　　1. tOGD可減輕 PC12神經(jīng)元樣細(xì)胞 OGD損傷;
　　2. tOGD可抑制 BV2細(xì)胞在 OGD后2 h表達(dá) M

21、1(CD11b)標(biāo)記物,調(diào)控M1(CD32、iNOS、CD86)/M2(CD206、IL-10、CCL-22)mRNA表達(dá);
　　結(jié)論
　　CIP可調(diào)控MCAO誘導(dǎo)的局灶性腦缺血皮層小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多,活化過程提前,參與CIP神經(jīng)保護(hù)作用,小膠質(zhì)細(xì)胞免疫功能調(diào)控發(fā)揮保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與調(diào)控缺血性腦卒中早期小膠質(zhì)細(xì)胞的 M1/M2極化狀態(tài),抑制 TLR-2/4炎癥信號通路過度活化,促使腦內(nèi)IκB-α早期升高,并始終維持T