誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和遠(yuǎn)期短期腦缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)動(dòng)脈損傷的治療作用及其機(jī)制.pdf

1、目前，來(lái)源于體細(xì)胞的誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(iPS)細(xì)胞類似于胚胎干細(xì)胞，可以表達(dá)多功能性的標(biāo)志物且在體內(nèi)外都具有分化為三個(gè)胚層細(xì)胞的潛能，但胚胎干細(xì)胞應(yīng)用于人體存在倫理學(xué)和免疫排異問(wèn)題，而iPS細(xì)胞不存在倫理學(xué)問(wèn)題又具備胚胎干細(xì)胞的生物特性，同時(shí)從患者自身的細(xì)胞制備而來(lái)，所以具有廣泛的應(yīng)用前景。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)iPS細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附的整合素β亞基主要是整合素β1。文獻(xiàn)提示，microRNA-217在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分化

2、和血管新生中起重要作用。
　　因此我們以小鼠股動(dòng)脈內(nèi)膜損傷為模型，研究iPS細(xì)胞在血管內(nèi)膜損傷中的作用及其機(jī)制。
　　第一部分:在成功制備出誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的前提下進(jìn)行體內(nèi)研究。C57BL/6J8-10周齡雄性小鼠，每組動(dòng)物都復(fù)制標(biāo)準(zhǔn)金屬絲擦傷股動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型，然后分別于術(shù)后當(dāng)天和術(shù)后第三天從尾靜脈注射PBS、MEF（胚胎成纖維細(xì)胞）、iPS，細(xì)胞劑量為6*104個(gè)/次/200μl，動(dòng)物的觀察周期為3周，為了明確iPS細(xì)胞

3、進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后的去向，我們采用術(shù)后從小鼠尾靜脈注射帶紅色熒光染料PKH的iPS細(xì)胞，觀察24h后留取股動(dòng)脈，共聚焦熒光顯微鏡觀察iPS細(xì)胞在血管處的著位點(diǎn);通過(guò)各組血管HE染色情況評(píng)價(jià)3周后各組動(dòng)物血管內(nèi)膜/中膜厚度的比值。結(jié)果顯示通過(guò)術(shù)后從小鼠尾靜脈注入帶紅色熒光染料PKH的iPS細(xì)胞，24h后于共聚焦熒光顯微鏡下觀察，證實(shí)iPS細(xì)胞僅著位于損傷的血管內(nèi)膜處;同時(shí)，各組動(dòng)物血管切片經(jīng)HE染色后統(tǒng)計(jì)血管內(nèi)膜/中膜厚度的比值，發(fā)現(xiàn)注射iP

4、S細(xì)胞組血管內(nèi)膜/中膜厚度的比值明顯小于其他各組(p＜0.05)。所以，我們首次證實(shí)iPS細(xì)胞僅著位于損傷血管內(nèi)膜處并對(duì)其有一定的修復(fù)作用。
　　第二部分:在iPS細(xì)胞對(duì)損傷血管內(nèi)膜有一定修復(fù)作用的基礎(chǔ)上，探討整合素β1（Integrin beta-1）在iPS細(xì)胞對(duì)損傷血管內(nèi)膜修復(fù)中的作用。C57BL/6J8-10周齡雄性小鼠，每組動(dòng)物都復(fù)制股動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型，然后分別于術(shù)后當(dāng)天和術(shù)后第三天從尾靜脈注射PBS、MEF、iPS、I

5、ntegrin beta-1 siRNAs-iPS，細(xì)胞劑量為6*104個(gè)/次/200μl，動(dòng)物的觀察周期為3周。由于Integrin beta-1 siRNAs-iPS組動(dòng)物于術(shù)后4-7天陸續(xù)死亡，我們對(duì)動(dòng)物生存情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)該組動(dòng)物存活率顯著低于其它組，形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Integrin beta-1 siRNAs-iPS在損傷的血管內(nèi)膜部位誘發(fā)血栓形成。為了避免血栓形成，我們將Integrin beta-1 siRNAs-iPS

6、的劑量降至iPS組的1/6，即1*104個(gè)/次/200μl，發(fā)現(xiàn)該劑量的Integrin beta-1siRNAs-iPS既無(wú)治療作用，也無(wú)副作用。TetO是在iPS制備時(shí)轉(zhuǎn)入的外源性基因，在接受iPS治療的動(dòng)物體內(nèi)不存在，所以可作為iPS的標(biāo)志基因，用熒光標(biāo)記原位雜交(FISH)的方法對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)定位，我們發(fā)現(xiàn)iPS治療3周后，在損傷的血管內(nèi)膜可檢測(cè)到該基因，而其它組均未發(fā)現(xiàn)基因探針整合。在接受Integrinbeta-1 siRNA

7、s-iPS細(xì)胞組（6*104個(gè)/次/200μl）的小鼠損傷內(nèi)膜亦檢測(cè)到FISH陽(yáng)性細(xì)胞。提示抑制整合素β1表達(dá)不能阻斷iPS定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞被剝脫的血管內(nèi)膜，但可阻斷iPS的治療作用，誘導(dǎo)血栓在損傷血管內(nèi)形成，導(dǎo)致動(dòng)物死亡。iPS細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后對(duì)損傷血管內(nèi)膜發(fā)揮修復(fù)作用依賴于Integrin beta-1。
　　第三部分:由于microRNA-217在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分化和血管新生中起重要作用，我們假設(shè)其可能對(duì)iPS

8、的遠(yuǎn)動(dòng)和對(duì)血管損傷的治療作用存在類似的影響。因此本部分研究探討microRNA-217在iPS細(xì)胞對(duì)損傷血管內(nèi)膜修復(fù)中作用。C57BL/6J8-10周齡雄性小鼠，每組動(dòng)物都復(fù)制股動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型，然后分別于術(shù)后當(dāng)天和術(shù)后第三天從尾靜脈注射PBS、MEF、iPS、ControlsiRNA-iPS、microRNA217-iPS，細(xì)胞劑量為6*104個(gè)/次/200μl，動(dòng)物的觀察周期為3周。各組動(dòng)物血管經(jīng)HE形態(tài)學(xué)染色后統(tǒng)計(jì)血管內(nèi)膜/中膜厚

9、度的比值，發(fā)現(xiàn)注射iPS或ControlsiRNA-iPS細(xì)胞組的比值明顯小于其它組(p＜0.05)，提示microRNA217阻斷了iPS對(duì)血管損傷的治療作用。細(xì)胞熒光染色定位方法發(fā)現(xiàn)，注入動(dòng)物體內(nèi)iPS或ControlsiRNA-iPS細(xì)胞3周后存在于損傷血管內(nèi)膜處，而在其它組的血管內(nèi)膜，包括microRNA217-iPS組，未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。提示miR-217在iPS治療血管損傷中起關(guān)鍵作用。miR-217的靶基因Sirt1，所以，推

10、測(cè)Sirt1對(duì)iPS發(fā)揮治療功能有重要影響。
　　目的:以大鼠實(shí)驗(yàn)性左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血性腦卒中(MCAO)為模型，研究腦短期缺血預(yù)適應(yīng)(Ischemic preconditioning，IPC)在腦缺血再灌注損傷的遠(yuǎn)期保護(hù)作用并探討HO-1和腺苷受體A1的作用。
　　方法:Wistar12周齡雄性大鼠，實(shí)驗(yàn)組夾閉左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈20min做缺血預(yù)處理，對(duì)照組夾閉左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈2s。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別采用PBS、HO-1誘導(dǎo)劑Hem

11、in、HO-1抑制劑Znpp、腺苷A1受體拮抗劑DPCPX處理，各組動(dòng)物3周后均進(jìn)行MCAO術(shù)。采用神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織梗死面積大?。═TC染色法）評(píng)價(jià)缺血預(yù)處理和HO-1的保護(hù)作用;用免疫組織化學(xué)法和Western blotting方法檢測(cè)HO-1及腺苷受體的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:Longa神經(jīng)功能評(píng)分法表明，缺血預(yù)處理20min可明顯改善大鼠MCAO術(shù)后神經(jīng)功能損傷情況，腦梗死面積顯著縮小。Hemin可以促進(jìn)缺血預(yù)處理的保護(hù)作

12、用。免疫組織化學(xué)及Western blotting結(jié)果顯示HO-1、腺苷受體A1和A2a在腦組織梗死邊緣區(qū)的表達(dá)量明顯高于梗死區(qū)。Western blotting結(jié)果顯示Znpp可使缺血預(yù)處理后HO-1的表達(dá)量在梗死區(qū)腦組織及邊緣區(qū)腦組織中反饋性地增加。
　　結(jié)論:首次發(fā)現(xiàn)短期腦缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)腦缺血再灌注損傷有遠(yuǎn)期保護(hù)作用，至少可持續(xù)至3周;HO-1在腦缺血預(yù)適應(yīng)的遠(yuǎn)期保護(hù)作用中起重要作用;在對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用中，HO-1