腦缺血預(yù)處理對(duì)沙土鼠腦缺血再灌注后HSP22表達(dá)的影響及其神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、目的： 缺血性卒中以其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率嚴(yán)重危害著人類健康。缺血性腦損傷的病理生理機(jī)制極為復(fù)雜，其涉及的許多相關(guān)基因和蛋白的改變及其復(fù)雜的聯(lián)系尚未研究清楚。腦缺血預(yù)處理(BIP)是指對(duì)大腦預(yù)先進(jìn)行一次或多次短暫的非致死性缺血刺激后，機(jī)體獲得對(duì)致死性腦缺血的耐受性。BIP的本質(zhì)是通過激發(fā)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，促進(jìn)新的蛋白質(zhì)合成，從而阻止或減弱腦缺血引起的缺血性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。HSP22是一個(gè)哺乳動(dòng)物小熱休克蛋白(sHSPs)家族

2、新成員，在所有肌肉相關(guān)組織和腦組織表達(dá)，它具有分子伴侶樣活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等作用。本研究采用沙土鼠前腦缺血再灌注模型以及應(yīng)用BIP進(jìn)行干預(yù)。一方面觀察BIP對(duì)缺血腦組織超微結(jié)構(gòu)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、HSP22mRNA及蛋白表達(dá)以及凋亡相關(guān)因子Bcl-2、BaxmRNA及蛋白表達(dá)和活化caspases-3蛋白表達(dá)變化的影響；另一方面觀察BIP對(duì)缺血腦組織MAP2、GFAPmRNA及蛋白表達(dá)變化的影響，以及通過免疫熒光共聚焦顯微鏡和免疫金雙重標(biāo)記

3、電鏡觀察HSP22與MAP2是否在神經(jīng)元共定位和HSP22與GFAP是否在星形膠質(zhì)細(xì)胞共定位。進(jìn)一步探討B(tài)IP對(duì)沙土鼠腦缺血再灌注后HSP22表達(dá)的影響及其神經(jīng)保護(hù)作用。 方法： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備及分組取健康雄性沙土鼠120只，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、假手術(shù)組、缺血再灌注(I/R)組和預(yù)缺血(IPC)組，I/R組和IPC組又隨機(jī)分為1d、3d和7d亞組。對(duì)照組和假手術(shù)組各18只；I/R組和IPC組1d、7d亞組各12只

4、，3d亞組各18只。通過夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10分鐘的方法建立沙土鼠前腦缺血再灌注模型。IPC組沙土鼠在夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10分鐘前2天給予間斷一天的2次2分鐘缺血。 2、透射電鏡觀察BIP對(duì)神經(jīng)組織超微結(jié)構(gòu)的改變。 3、TUNEL染色方法檢測(cè)BIP對(duì)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。 4、免疫熒光共聚焦方法觀察BIP后HSP22分別與神經(jīng)元細(xì)胞骨架蛋白MAP2和星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白GFAP共定位的情況。 5、電鏡免疫

5、金雙重標(biāo)記方法觀察BIP后HSP22分別與神經(jīng)元細(xì)胞骨架蛋白MAP2和星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白GFAP共定位的情況。 6、RT-PCR方法檢測(cè)BIP對(duì)腦組織中HSP22、Bcl-2、Bax、MAP2、GFAP基因的mRNA表達(dá)的影響。 7、Western blot方法檢測(cè)BIP對(duì)腦組織中HSP22、Bcl-2、Bax、caspase-3、MAP2、GFAP蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1、沙土鼠前腦皮層神經(jīng)細(xì)胞超

6、微結(jié)構(gòu)的變化 正常對(duì)照組和假手術(shù)組前腦皮層神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常。I/R組3d亞組可觀察到細(xì)胞核膜模糊，胞質(zhì)內(nèi)線粒體多有嵴減少，外膜局部破壞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張。IPC組3d亞組也可觀察到上述損傷的神經(jīng)細(xì)胞，但超微結(jié)構(gòu)的損傷明顯減輕。 2、沙土鼠前腦皮層TUNEL染色結(jié)果 正常對(duì)照組和假手術(shù)組沙土鼠前腦皮層幾乎未見TUNEL染色陽性細(xì)胞。I/R組1d亞組凋亡細(xì)胞數(shù)較少，3d、7d亞組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，且隨時(shí)間延長(zhǎng)

7、，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多。IPC組在1d、3d、7d亞組凋亡細(xì)胞數(shù)分別較腦缺血再灌注組明顯減少(P<0.05)。 3、沙土鼠前腦皮層免疫熒光共聚焦結(jié)果 HSP22的紅色免疫熒光及MAP2的綠色免疫熒光在神經(jīng)元細(xì)胞漿和樹突內(nèi)發(fā)生了明顯的重疊。HSP22的紅色免疫熒光及GFAP的綠色免疫熒光在星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體和突起發(fā)生了明顯的重疊。 4、沙土鼠前腦皮層電鏡免疫金雙重標(biāo)記觀察結(jié)果 HSP22免疫金顆粒(10n

8、m)與MAP2免疫金顆粒(15nm)在神經(jīng)元細(xì)胞漿和樹突內(nèi)發(fā)生了明顯的重疊。HSP22免疫金顆粒(10nm)與GFAP免疫金顆粒(15nm)在星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿和突起內(nèi)發(fā)生了明顯的重疊。 5、HSP22基因的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果 預(yù)缺血組第3d腦組織HSP22mRNA表達(dá)與缺血再灌注組比較顯著增加(p<0.05)。預(yù)缺血組第1d、3d、7d腦組織HSP22蛋白表達(dá)與缺血再灌注組比較顯著增加(p<0.05)。

9、6、Bcl-2、Bax基因的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果 預(yù)缺血組第3d腦組織Bcl-2mRNA表達(dá)與缺血再灌注組比較顯著增加(p<0.05)，預(yù)缺血組第1d、3d、7d腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)與缺血再灌注組比較顯著增加(p<0.05)；缺血再灌注組第3d腦組織BaxmRNA表達(dá)與預(yù)缺血組比較顯著增加(p<0.05)，缺血再灌注組第1d、3d、7d腦組織Bax蛋白表達(dá)與預(yù)缺血組比較顯著增加(p<0.05)；預(yù)缺血組第3d腦組織Baxm

10、RNA表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異無顯著性(p>0.05)，預(yù)缺血組第1d、3d、7d腦組織Bax蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異無顯著性(p>0.05)。 7、活化caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果 預(yù)缺血組第1d、3d、7d腦組織活化caspase-3蛋白表達(dá)與缺血再灌注組比較顯著降低(p<0.05)。 8、MAP2基因的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果 預(yù)缺血組第3d腦組織MAP2mRNA表達(dá)與缺血再灌注組比較顯著增加(

11、p<0.05)，預(yù)缺血組第1d、3d、7d腦組織MAP2蛋白表達(dá)與缺血再灌注組比較顯著增加(p<0.05)。 9、GFAP基因的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果 預(yù)缺血組第3d腦組織GFAPmRNA表達(dá)與缺血再灌注組比較顯著降低(p<0.05)；預(yù)缺血組第1d、3d、7d腦組織GFAP蛋白表達(dá)與缺血再灌注組比較顯著降低(p<0.05)。 結(jié)論： 1、BIP能夠明顯地減輕沙土鼠缺血再灌注后前腦皮層神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損

12、傷，減少缺血再灌注后前腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡，增加腦缺血再灌注后前腦組織抗凋亡因子Bcl-2mRNA和蛋白的表達(dá)，降低活化caspase-3蛋白的表達(dá)，而促凋亡因子BaxmRNA和蛋白的表達(dá)則沒有顯著變化。 2、BIP能夠明顯地增加沙土鼠腦缺血再灌注后前腦組織HSP22mRNA和蛋白的表達(dá)。 3、BIP能夠明顯地增加沙土鼠腦缺血再灌注后前腦組織神經(jīng)元骨架蛋白MAP2mRNA和蛋白的表達(dá)；HSP22和MAP2共定位于沙土鼠前腦