類泛素蛋白NEDD8賴氨酸功能研究和修飾底物鑒定.pdf

1、背景和目的：
　　泛素樣蛋白NEDD8（Neural-precursor-cell-Expressed Developmentally Down-regulated8）是最重要的類泛素化蛋白之一，其與底物蛋白的結合過程稱為neddylation。Neddylation修飾與腫瘤細胞的增殖、轉錄因子的調控等高度相關。泛素的7個賴氨酸可以形成不同的泛素鏈結構，在各種生化過程中發(fā)揮著重要的作用。然而NEDD8上不同賴氨酸的功能至今尚未被

2、研究。本課題中，我們將NEDD8中的各個賴氨酸分別突變成精氨酸，從而獲得9個NEDD8突變體，研究了NEDD8上賴氨酸的潛在功能。作為E3泛素連接酶的一個組成蛋白，cullins是最早被發(fā)現可被NEDD8修飾的底物蛋白，cullins的neddylation修飾可以激活cullin-RING E3（CRL E3）泛素連接酶的活性。相比泛素修飾的底物蛋白研究，NEDD8修飾底物蛋白的研究少之又少。本課題中，我們通過親和層析方法來分離富集N

3、EDD8修飾的底物蛋白，并用質譜進行鑒定。
　　方法：
　　構建將各個賴氨酸分別突變成精氨酸的9個NEDD8突變體，在HEK293T細胞中過表達 NEDD8野生型和突變體，免疫印跡在全蛋白液中檢測各個突變體對neddylation修飾的影響，找到關鍵賴氨酸；共轉染NEDD8野生型、突變體與NEDD8激活酶NAE1/Uba3、結合酶UBE2M，免疫印跡檢測關鍵賴氨酸的突變對NEDD8的激活、結合過程的影響；共轉染NEDD8野生

4、型、突變體與 cullins家族蛋白，純化cullins后免疫印跡檢測關鍵賴氨酸的突變對底物蛋白neddylation修飾及泛素修飾的影響；共轉染NEDD8野生型、突變體與cullins家族成員與CRL E3泛素連接酶底物，純化CRL E3泛素連接酶底物后免疫印跡檢測關鍵賴氨酸的突變對底物蛋白泛素化的影響；大量過表達帶His6親和標簽的NEDD8，通過標簽親和純化NEDD8修飾蛋白，胰蛋白酶酶解后獲得多肽片段，用質譜分析獲得其底物蛋白。

5、
　　結果：
　?。?）K27R NEDD8突變體抑制了蛋白質neddylation修飾。
　?。?）K27R NEDD8未影響NEDD8的激活過程。
　?。?）K27R NEDD8突變體通過與NEDD8結合酶UBE2M形成穩(wěn)定的共價鍵，影響了NEDD8的結合過程。
　?。?）K27R NEDD8突變體影響了cullins的neddylation修飾。
　?。?）K27R NEDD8突變體也影響了cu

6、llins的泛素化修飾。
　?。?）K27R NEDD8突變體大大降低了cullin RING E3泛素連接酶底物IB的泛素化修飾。
　?。?）質譜分析共鑒定了84種NEDD8修飾蛋白，其中67種是新鑒定到的潛在NEDD8修飾底物蛋白，如染色體濃縮調節(jié)蛋白RCC等蛋白。
　　結論：
　　我們在NEDD8中發(fā)現了一個影響底物蛋白neddylation修飾的賴氨酸。NEDD8第27位賴氨酸的突變可以抑制neddyla

7、tion修飾。其作用機制為K27R NEDD8突變體與結合酶UBE2M形成了某種穩(wěn)定的共價鍵，從而無法與UBE2M形成硫酯鍵，進而阻斷neddylation的下游進程。K27R NEDD8突變體可以抑制cullins的neddylation修飾與泛素化修飾，從而影響了cullins相關的E3泛素連接酶的活性及其底物蛋白質的泛素化。K27R NEDD8突變體在研究蛋白質neddylation修飾的生化功能中可以作為重要的顯性負性突變體；N