綠色熒光蛋白標記結(jié)合SEM-EDS技術(shù)觀測兔BMSCs體外礦化的研究.pdf

1、目的：觀察綠色熒光蛋白(GFP)標記的兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨誘導后形態(tài)學改變及體外成骨中礦化鈣結(jié)節(jié)的形成，并結(jié)合掃描電鏡和X射線能譜分析(SEM/EDS)技術(shù)對礦化鈣結(jié)節(jié)進行微觀形貌觀察和定量能譜分析，并對GFP標記的兔BMSCs復合脫鈣骨(DBM)支架體外構(gòu)建組織工程骨表面進行微觀形貌和生物礦化進行觀測。
　　方法：用攜帶GFP基因的腺病毒(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染兔BMSCs進行示蹤標記，并誘導細胞向成骨方向分化，通過

2、倒置熒光顯微鏡、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色觀察成骨誘導后細胞形態(tài)改變和礦化鈣結(jié)節(jié)的形成，結(jié)合SEM/EDS技術(shù)觀測礦化鈣結(jié)節(jié)的表面微觀結(jié)構(gòu)及其元素構(gòu)成。用GFP標記的BMSCs與DBM復合經(jīng)成骨誘導后，通過倒置熒光顯微鏡對細胞生長情況進行即時觀察，結(jié)合SEM/EDS技術(shù)觀測組織工程骨的表面微觀形貌和生物礦化。
　　結(jié)果：Ad-GFP轉(zhuǎn)染兔BMSCs后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，經(jīng)成骨誘導后細胞形態(tài)向成骨方向分化，并形成不透光的礦化鈣結(jié)節(jié)，

3、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色見紅色礦化結(jié)節(jié)，電鏡下見礦化鈣結(jié)節(jié)散布于細胞中，細胞重疊生長，分泌基質(zhì)旺盛。X射線能譜分析顯示礦化鈣結(jié)節(jié)主要組成元素與正常骨組織相同，其鈣磷比(Ca/P)為1.55，接近正常骨組織鈣磷比1.49。用GFP標記的BMSCs與DBM復合體外構(gòu)建組織工程骨，經(jīng)成骨誘導后，在倒置熒光顯微鏡下見細胞在DBM支架上能較好的黏附、重疊生長和增殖，體外培養(yǎng)至14天時，細胞內(nèi)GFP有較高水平瞬時表達。電鏡下見DBM呈疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔隙直徑

4、在300～600μm之間，孔隙率達90％。電鏡下觀察組織工程骨，見細胞在DBM網(wǎng)孔內(nèi)表面貼壁生長，分泌基質(zhì)旺盛，并可見粗糙的生物礦化物覆蓋支架。用X射線能譜分析顯示其表面為鈣、磷沉積物，其鈣磷比(Ca/P)為1.46。
　　結(jié)論：Ad-GFP能成功轉(zhuǎn)染并標記兔BMSCs，并能直接動態(tài)即時觀察BMSCs的成骨分化過程中的細胞形態(tài)改變和空間分布;成骨誘導后BMSCs向成骨方向分化，具備較好的成骨能力;BMSCs體外礦質(zhì)化成骨過程與體內(nèi)