黃芩苷對子癇前期血清誘導(dǎo)HUVECs增殖和ICAM-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:觀察子癇前期患者(濕熱瘀結(jié)證）臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)；探討子癇前期（PE）患者的血清對體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖和ICAM-1表達(dá)的影響；觀察不同濃度黃芩苷(BAI)對血清誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)而選擇最佳藥物濃度；觀察藥物對HUVECs細(xì)胞上ICAM-1表達(dá)的影響。探討黃芩苷對PE濕熱瘀結(jié)證防治作用的靶點(diǎn)及可能機(jī)制，規(guī)范藥物最佳有效濃度，為黃芩苷的進(jìn)一步臨床廣泛應(yīng)用提供理

2、論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:第一部分臨床觀察中選取濕熱瘀結(jié)證子癇前期PE患者50例及正常妊娠孕婦(NP）50例。子癇前期的西醫(yī)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《婦產(chǎn)科學(xué)》(第七版)。中醫(yī)辨證分型診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)。無菌采血后分離出血清，56℃30min滅活補(bǔ)體，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。適宜的分娩方式下收集臍帶-80℃保存。隨機(jī)選取PE和NP組中的各20段臍帶，SABC法測定血管內(nèi)皮上細(xì)胞ICAM-1表達(dá)。第二部分實(shí)驗(yàn)研究，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（簡稱HU

3、VECs)，理論上可無限次的傳代培養(yǎng)，易于實(shí)驗(yàn)操作。含10％子癇前期血清 DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)HUVECs48h建立PE患者體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。正常孕婦的血清48h的HUVECs作為陰性對照。分子癇前期模型a組，正常b組（陰性對照組），黃芩苷治療c組（PE模型+黃芩苷），共3大組。收獲a組和b組融合成單層呈鋪路石狀HUVECs，調(diào)整細(xì)胞密度，分別接種到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄舊培養(yǎng)液，加入含或不含黃芩苷的培養(yǎng)基，黃芩苷按高低濃度梯度

4、加入對應(yīng)的孔中，復(fù)5個(gè)平行孔，做好標(biāo)記。培養(yǎng)箱中孵育24h進(jìn)行 cck-8實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，分別調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104細(xì)胞/孔，1×104細(xì)胞/孔，5×103細(xì)胞/孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。收獲 a組，b組融合成單層呈鋪路石狀的HUVECs，根據(jù)摸索結(jié)果，調(diào)整最佳細(xì)胞密度接種到96孔板中，方法同上，根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整黃芩苷不同濃度后加入對應(yīng)的孔中進(jìn)行孵育，操作同上。傳代細(xì)胞貼壁后，建立子癇前期模型 a組和正常妊娠 b組，進(jìn)行標(biāo)記

5、；設(shè)立藥物治療c組：PE模型造好換含有效濃度的黃芩苷培養(yǎng)液，干預(yù)24h。收集a、b、c三組細(xì)胞，RT-PCR、蛋白印跡法方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1表達(dá),記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:（1）臨床臍帶標(biāo)本的血管內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1陽性表達(dá)于子癇前期模型（PE）組，呈棕褐色胞漿著色。免疫組化平均光密度值示PE組(51.42±4.46)顯著高于正常妊娠（NP）組(14.68±2.73)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）PE內(nèi)皮損傷模型組內(nèi)皮

6、細(xì)胞增殖活性(OD值1.49±0.08)較NP組(1.18±0.07)有明顯的增加，p＜0.01；黃芩苷抑制PE組內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）PE模型組內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1 mRNA(倍增值4.68±0.20)表達(dá)明顯高于 NP組(1.16±0.19)，p＜0.01；黃芩苷(60μg/ml)干預(yù)后顯著抑制了PE組ICAM-1 mRNA的表達(dá)（1.51±0.07），p＜0.01，與 NP組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（4）PE組ICAM

7、-1蛋白(0.64±0.05)表達(dá)顯著高于NP組(0.37±0.05)，p＜0.01；黃芩苷(60μg/ml)干預(yù)后明顯降低了PE組 ICAM-1蛋白的表達(dá)（0.41±0.01），P＜0.01，但是與NP組相比，藥物干預(yù)后ICAM-1蛋白的表達(dá)變化無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p＞0.05。
　　結(jié)論:（1）臨床觀察中濕熱瘀結(jié)證型子癇前期患者臍帶內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1出現(xiàn)陽性表達(dá)。（2）體外實(shí)驗(yàn)中濕熱瘀結(jié)證子癇前期患者血清促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)

8、胞的失衡性增殖；黃芩苷抑制PE血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的失衡性增殖以及表面粘附分子ICAM-1的過表達(dá)；黃芩苷在有效濃度為60μg/ml時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖得到有效抑制，同時(shí)細(xì)胞增殖活性與正常組最為接近。黃芩苷對子癇前期（濕熱瘀結(jié)證）的防治有一定作用，可能是通過抑制病理環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞的失衡性增殖，抑制細(xì)胞表面粘附分子的過表達(dá)從而維持內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與凋亡平衡，降低血管內(nèi)皮的粘附，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。（3）基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中內(nèi)皮細(xì)胞接種到96孔