玉米絲氨酸消旋酶作為新型篩選標記轉化煙草的研究.pdf

1、絲氨酸消旋酶是一種雙功能酶，擁有消旋酶和脫水酶的作用，不僅能催化L-型和D-絲氨酸的相互轉化，還能將L-/D-絲氨酸轉化成丙酮酸。本研究利用玉米絲氨酸消旋酶基因，通過農桿菌介導法對煙草葉片及愈傷組織進行遺傳轉化，同時用GUS基因導入煙草中作為對照，對比玉米絲氨酸消旋酶和GUS基因在葉片及愈傷組織的轉化效果，為ZmSR作為新型無抗性篩選標記奠定基礎。本研究獲得了以下結果：
　　1、根據玉米絲氨酸消旋酶預測基因（NM_00114302

2、8.1）的登錄號在NCBI上進行搜索，得知玉米絲氨酸消旋酶基因的片段大小為1303 bp。對重組質粒pCAMBIA1301-ZmSR，用Nco I和BstPⅠ進行雙酶切驗證，酶切產物電泳檢測得到ZmSR和pCAMBIA1301載體兩個大小的片段，初步證明ZmSR基因連接到pBI1301載體上。對載體pBI1301-ZmSR進行測序分析，測序結果與NCBI網站上所給出的ZmSR基因的序列完全一致。
　　2、制備根癌農桿菌LBA440

3、4感受態(tài)細胞，并用液氮凍融法將pBI1301-ZmSR質粒導入到LBA4404感受態(tài)細胞中。從農桿菌中提取質粒，進一步酶切驗證重組質粒pBI1301-ZmSR，結果仍得到ZmSR和pCAMBIA1301載體兩個大小的片段。根據玉米絲氨酸消旋酶預測基因序列設計引物，對新提取的農桿菌pBI1301-ZmSR質粒與pBI1301-ZmSR原始質粒進行PCR驗證，擴增出了玉米絲氨酸消旋酶基因的陽性克隆，證明了重組質粒已成功導入農桿菌中，可以用來

4、進行遺傳轉化。
　　3、通過對煙草培養(yǎng)基條件的篩選，優(yōu)化了煙草葉片最佳誘導愈傷的培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.5 mg/L+NAA2.0 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂6 g/L。該培養(yǎng)基的誘導愈傷的誘導率為100％，并且速度最快，愈傷增殖的效果最好。
　　4、本研究以質粒pBI1301-ZmSR為目的基因，以質粒pBI121-GUS作為對照，分別用D-絲氨酸和Kan作為篩選試劑，對未轉化植株進行Kan和D-絲氨酸抗性臨界濃

5、度的篩選。對煙草葉片進行卡那霉素及D-絲氨酸的抗性敏感性試驗，分別確定臨界濃度為50 mg/L和12 mM。對煙草愈傷組織進行卡那霉素及D-絲氨酸的抗性敏感性試驗，分別確定煙草愈傷組織的臨界濃度為30 mg/L和6 mM。
　　5、用農桿菌介導法將pBI1301-ZmSR和pBI121-GUS分別轉入到煙草葉片和愈傷組織中，經分子檢測由葉片篩選獲得的pBI1301-ZmSR抗性苗有3株為陽性植株，由愈傷組織獲得的抗性苗有6株為陽性