酶法拆分制備D-絲氨酸以及近紅外在線監(jiān)控酶法轉(zhuǎn)化制備γ-氨基丁酸.pdf

1、20世紀初期人類發(fā)現(xiàn)了味精，并開始使用發(fā)酵法大規(guī)模地生產(chǎn)各種常見氨基酸，到了21世紀氨基酸產(chǎn)業(yè)經(jīng)歷了100年的發(fā)展，由于高能耗以及行業(yè)間的價格打壓，氨基酸產(chǎn)業(yè)慢慢地被少數(shù)幾家大公司所壟斷。然而小品種氨基酸包括各類D型氨基酸由于其獨特的生理生化功能，已經(jīng)被制成多種類型的保健品，開始被人們慢慢地接受，逐漸受到重視。小品種氨基酸剛剛起步，由于無法使用傳統(tǒng)發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)，因此生產(chǎn)工藝尚待開發(fā)。
　　論文采用最新的基因工程技術(shù)，制得高絲氨酸

2、羥甲基轉(zhuǎn)移酶活力的菌體細胞，為L-絲氨酸的合成提供上游技術(shù)支持。使用實驗室之前克隆表達的色氨酸酶，為下游同時生產(chǎn)D-絲氨酸及L-色氨酸提供了綠色的合成思路。沿用實驗室之前克隆表達的高活力谷氨酸脫羧酶，為γ-氨基丁酸的中試生產(chǎn)提供了指導(dǎo)性的建議。同時使用近紅外光譜分析技術(shù)對γ-氨基丁酸的酶促轉(zhuǎn)化制備過程進行了實時監(jiān)控，為小品種氨基酸的酶法轉(zhuǎn)化清潔生產(chǎn)以及在線監(jiān)控奠定了基礎(chǔ)。
　　本論文首先以E.coli BL21(DE3)菌株基因組

3、DNA為模板，設(shè)計引物進行PCR擴增絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因。構(gòu)建重組載體pET-21 a(+)-SHMT，在基因水平、蛋白水平和酶活力測試中，同時證明了該酶的成功表達，克隆表達出來的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活力是正常E.coli BL21(DE3)菌株活力的10倍。
　　在使用色氨酸酶催化D，L-絲氨酸和吲哚制備L-色氨酸和D-絲氨酸時，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對合成條件進行了優(yōu)化，得到了酶法合成的最優(yōu)條件:色氨酸酶質(zhì)量濃度為6g/L，D，L-

4、絲氨酸質(zhì)量濃度30 g/L，吲哚60 g/L，反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)pH8.0，反應(yīng)時間18 h，經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸的總轉(zhuǎn)化率可達95.4％。D-絲氨酸的，比旋光度-15.3°(C=10，2N HCl)同標準品D-絲氨酸一致，化學(xué)純度為99.4％，提取分離的總回收率為66.6％。
　　對以L-谷氨酸為底物利用谷氨酸脫羧酶酶法制備γ-氨基丁酸的合成條件進行優(yōu)化，得到了酶法合成的最優(yōu)條件:高產(chǎn)谷氨酸脫羧酶細胞液以2.48 g/

5、(L·h)的速度流加4.33h，終酶量達到10.7 g/L，反應(yīng)在5h即可完成。同時使用近紅外光譜分析技術(shù)實時監(jiān)控反應(yīng)過程，為了克服不溶性底物以及混懸菌體細胞液的干擾，設(shè)計了19μm和0.2μm的串聯(lián)過濾膜系統(tǒng)，得到了澄清液體的近紅外模型，L-谷氨酸濃度范圍在3.54 g/L-41.91g/L波動條件下的預(yù)測精度（RMSEP）為1.58 g/L，γ-氨基丁酸在7.05 g/L-125.52 g/L的波動條件下預(yù)測精度(RMSEP)為3.