酶法轉化制備L-瓜氨酸暨精氨酸脫來氨基酶的性質研究.pdf

1、精氨酸脫亞氨基酶（Argininedeiminase，EC3.5.3.6;ADI）催化L-精氨酸水解為L-瓜氨酸和氨，與鳥氨酸氨甲酰轉移酶、氨基甲酸激酶共同組成精氨酸脫亞氨基酶途徑，廣泛分布于一些以精氨酸為主要能量來源的細菌、古細菌及少數(shù)低等真核生物中。精氨酸脫亞氨基酶除了可用于酶法生產(chǎn)L-瓜氨酸外，還被證明是一種潛在的抗癌藥物，可有效抑制精氨酸缺陷型腫瘤細胞的生長（如黑色素瘤、肝癌細胞），抗白血病作用等，在醫(yī)療領域具有廣闊的應用前景。

2、目前，研究人員已經(jīng)在大腸桿菌中克隆表達了來源于支原體(Mycoplasma)、假單胞菌（Pseudomonasplecoglossicida）、鏈球菌（Streptococcussanguis）、賈第鞭毛蟲（GiardiaIntestinalis）等微生物的ADI基因。但是，它們在大腸桿菌中主要以包涵體形式存在，活性較低，不利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)L-瓜氨酸及作為抗腫瘤制劑的研究。
　　本文分別選取生活環(huán)境差異顯著的云南騰沖嗜熱桿菌（T

3、hermoanaerobactertengcongensisMB4）、惡臭假單胞菌（PseudomonasputidaATCC4359）及威爾李斯特菌(Listeriawelshimeriserovar6bstr.SLCC5334P)的ADI基因序列，分別命名為TADI、PADI、LADI。同源性比對結果顯示:三種ADI的氨基酸序列之間差異較大，同源性較低，暗示其可能存在較為顯著的性質差異，有利于發(fā)掘新穎特性，應用于酶法制備L-瓜氨酸及

4、抗腫瘤制劑研究。
　　在大腸桿菌系統(tǒng)中，通過構建多種不同類型的表達載體，優(yōu)化培養(yǎng)條件，三種重組蛋白仍主要以無活性的包涵體形式存在。通過探索，本論文發(fā)現(xiàn)了一種新的促進精氨酸脫亞氨基酶高效水溶性表達的方法。在分子伴侶GroEL-GroES共表達的基礎上，在LB培養(yǎng)基中通過添加0.5％D-葡萄糖和0.5％L-精氨酸進行共誘導培養(yǎng)，可分別使rPADI、rLADI的水溶性產(chǎn)量顯著提高至15、7倍。然而，rTADI蛋白通過截短表達、體外復性、

5、分子伴侶共表達等多種優(yōu)化策略均未能獲得活性蛋白。
　　通過鎳柱親和層析純化得到天然的rPADI和rLADI蛋白，分別對其進行了酶學性質研究。rPADI的最適溫度為40℃，最適pH為6.0，比酶活為76±0.03U/mg，Km值為0.34mM，水溶性產(chǎn)量可達到45-50mg/L，其催化能力及水溶性產(chǎn)量均位于文獻報道的中上游水平。rLADI的最適溫度為45℃，最適pH為6.0，比酶活為3.12±0.01U/mg，Km值為46.2mM。

6、Cr3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Hg2+、SDS、DTT可強烈抑制rLADI的活性。溫度和pH的輕微變化，金屬離子及化學試劑的存在均會顯著影響rLADI的催化能力。鑒于rPADI在水溶性、催化能力等方面的優(yōu)勢，本文利用rPADI的粗酶液直接進行L-瓜氨酸的轉化研究，發(fā)現(xiàn)25ml重組菌體制備的粗酶液可將20gL-精氨酸有效轉化為L-瓜氨酸，轉化率高于90％，具有潛在的應用價值。
　　探尋高水溶性及高催化能力的精氨酸脫亞氨基酶