酶促高效轉(zhuǎn)化L-絲氨酸過(guò)程優(yōu)化及其生命周期評(píng)價(jià).pdf

1、作為一種常見(jiàn)的組成蛋白質(zhì)的氨基酸，L-絲氨酸主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。生物體內(nèi)，L-絲氨酸可以用于合成嘌呤、胸腺嘧啶、膽堿等前體，L-絲氨酸還可作為中間體，用于合成L-色氨酸、L-多巴、L-半胱氨酸等物質(zhì)。L-絲氨酸合成方法中，酶法以良好的催化專一性、反應(yīng)條件溫和、易滿足等優(yōu)點(diǎn)成為生產(chǎn)和研究的主要方向。但是，酶法合成L-絲氨酸存在檢測(cè)技術(shù)落后、轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)酸量低、污染嚴(yán)重等問(wèn)題，為了解決上述酶法合成L-絲氨酸工藝存在的技術(shù)難題

2、，本文開(kāi)展了詳細(xì)研究并得出如下主要結(jié)論：
　?。?）建立了一種新型的靈敏度高、重現(xiàn)性和選擇性好的HPLC–ESI-MS測(cè)定氨基酸含量的方法。A流動(dòng)相：0.01％甲酸水溶液，B流動(dòng)相：乙腈：水=70：30（v/v），流速為1 mL min?1，采用Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm×5μm)色譜柱，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為10μL，UV檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。洗脫梯度：0 min=90%A a

3、nd10%B，12 min=70%A and30%B，20 min=52%A and48%B，30 min=100%B，29分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)了15種氨基酸徹底分離及確認(rèn)。
　?。?）根據(jù)建立的HPLC–ESI-MS定量、確認(rèn)氨基酸新方法，對(duì)15種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的總離子流結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PITC-AA產(chǎn)物離子具有從母核分子上失去NH3（17 Da）、H2O（18 Da）或CO+H2O（46 Da）離子的特征。對(duì)建立的HPLC–ESI

4、-MS新方法進(jìn)行驗(yàn)證、評(píng)估，發(fā)現(xiàn)混合溶液中所含15種氨基酸，其對(duì)應(yīng)的線性范圍為630–20156μmol L?1，LOD、LOQ范圍分別為111–816、311–2721 pmolμL?1，日內(nèi)、日間精密度分別為0.924%–6.578%(n=6)、3.327%–9.845%(n=6 in3 d)，PITC-AA平均回收率為82.6%–112.0%。
　?。?）通過(guò)對(duì)酶法合成L-絲氨酸工藝過(guò)程的優(yōu)化研究，提供了一種高轉(zhuǎn)化率的酶法生

5、成L-絲氨酸方法。首先對(duì)影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的SHMT活性的因素進(jìn)行優(yōu)化，確定了pH8.0，50℃，CTAB0.03g L?1，DL-β-200μmol L?1，PLP0.012g L?1條件下，SHMT酶活最高可達(dá)1.246 U mg?1，進(jìn)一步研究了酶促轉(zhuǎn)化過(guò)程高濃度HCHO導(dǎo)致的反應(yīng)體系pH下降、抑制底物轉(zhuǎn)化的問(wèn)題，提出了以1.3 mmol h-1流速滴加HCHO的策略，控制反應(yīng)體系pH為7.5，實(shí)現(xiàn)了甘氨酸的高效轉(zhuǎn)化，最終轉(zhuǎn)化率高達(dá)95

6、.6%，與未采取滴加策略之前相比，轉(zhuǎn)化率提高近10%。
　?。?）研究建立了一種高收率制備產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸的工藝路線。通過(guò)對(duì)影響吸附和洗脫過(guò)程的參數(shù)優(yōu)化，確定了上樣溶液pH為9.0、吸附平衡時(shí)間20 min、洗脫劑為0.2磷酸緩沖液（pH5.0）、洗脫速度為0.4 mL min-1，50℃條件下，濃縮洗脫液至10:1（v/v）、60℃脫色30 min、過(guò)濾、冷卻、加入96%（v/v）甲醇溶液結(jié)晶3 h，80℃溶解、二次脫色、冷卻、陳

7、化結(jié)晶，80℃干燥，最終L-絲氨酸收率達(dá)75.17%。分離純化過(guò)程排放的主要污染物為離子交換分離階段排放的酸堿廢水，離子交換、脫色過(guò)程產(chǎn)生的廢樹(shù)脂、活性炭渣等，精制干燥工序產(chǎn)生的少量粉塵。
　?。?）首次采用生命周期評(píng)價(jià)方法對(duì)酶法合成L-絲氨酸工藝產(chǎn)生的環(huán)境影響進(jìn)行分析和定量。以年產(chǎn)500 t酶法合成L-絲氨酸工藝為研究對(duì)象，以菌體CTAB處理為研究起點(diǎn)，以產(chǎn)物干燥為終點(diǎn)，建立生命周期評(píng)價(jià)模型，通過(guò)各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理、加權(quán)評(píng)