亞低溫聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞移植治療小鼠缺氧缺血性腦病模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1.目的：
　　1.1.觀察體外培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的電生理特征。
　　1.2.NSCs植入缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)小鼠腦內(nèi)，分析其分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的電生理特征，探討NSCs治療HIE小鼠可能機(jī)制，并行安全性評(píng)估。
　　1.3.應(yīng)用亞低溫聯(lián)合NSCs移植治療小鼠缺氧缺血性腦病(HIE)，觀察其療效，探索亞低溫改善NSCs治療H

2、IE小鼠的可能機(jī)制。
　　2.方法：
　　2.1.體外分離并培養(yǎng)胚胎來(lái)源NSCs，探索其分化潛能，并進(jìn)行電生理功能鑒定。
　　2.2.將小鼠隨機(jī)分為三組:SHAM組（假手術(shù)組）;HIE+PBS組（安慰治療組）;HIE+NSCs組（治療組）。分別進(jìn)行移植細(xì)胞的追蹤鑒定，行為學(xué)的評(píng)價(jià)及安全性評(píng)估
　　2.3.將小鼠隨機(jī)分為五組:對(duì)照組(control組);HIE+hypothermia組（亞低溫治療組）;HIE組;

3、HIE+NSCs+ hypothermia組（亞低溫聯(lián)合NSCs治療組）;HIE+NSCs組（常溫治療組）。分析比較不同組間差異。
　　3.結(jié)果：
　　3.1.C57/BL6胎鼠來(lái)源的NSCs呈單一細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，并表達(dá)Nestin，Sox-2多能干性標(biāo)記物。貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)后，原有的單一形態(tài)發(fā)生變化。分化的神經(jīng)細(xì)胞分別表達(dá)NeuN，GFAP， CNPase神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞與少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物。其中，神經(jīng)元樣

4、細(xì)胞的靜息膜電位及全細(xì)胞電容值與未分化的狀態(tài)相比較有明顯差異(p＜0.5)。同時(shí)可記錄到能被Na+通道阻斷劑TTX阻斷的快速激活、快速失活的Na+內(nèi)向電流和瞬時(shí)外向的快失活鉀電流。
　　3.2.HIE+PBS組（安慰治療組）與HIE+NSC組（治療組）比較，梗死容積差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但HIE+NSC組（治療組）第1與4周相比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接受移植的新生鼠腦組織可見(jiàn)GFP標(biāo)記陽(yáng)性同時(shí)表達(dá)NeuN， GFA

5、P，CNPase標(biāo)記雙陽(yáng)性細(xì)胞，分別約占植入細(xì)胞比例的11～14％，63～77％和2～6％左右。4wek時(shí)GFP標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞較lweek時(shí)減少60％左右。其中，神經(jīng)元樣細(xì)胞的靜息膜電位，膜輸入阻抗及全細(xì)胞電容值與體外培養(yǎng)的神經(jīng)元樣細(xì)胞相比較沒(méi)有明顯差異。同時(shí)可記錄到Na+動(dòng)作電位和自發(fā)興奮性突觸后電流。Rotarod Test: NSC治療組小鼠至第21天時(shí)與PBS治療組相比差別具有顯著性差異(P＜0.05);Cylinder Test

6、: NSC治療組隨著時(shí)間恢復(fù)，21天后和PBS治療組的缺血側(cè)肢體的使用頻率也有顯著差異(P＜0.05);Morris水迷宮:而第2月和第6月相比較，NSC組小鼠的逃避潛伏期較PBS組縮短(P＜0.05)。
　　3.3.亞低溫能給移植細(xì)胞提供神經(jīng)保護(hù)， NSCs+hypothermia組的TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與HIE組，NSCs組相比較出現(xiàn)下降，但與Hypothermia組相似。NF-κB蛋白及pro-caspase3裂解活性形

7、式蛋白的表達(dá)水平在Hypothermia組和NSCs+hypothermia組都是顯著低于HIE組和NSCs組的。細(xì)胞移植后NSCs+hypothermia組的梗死體積都是顯著低于NSCs組的(p＜0.05)，低于hypothermia組(p＜0.05)。Rotarod test: NSCs+hypothermia組在所有檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)上的行為學(xué)改善都是顯著優(yōu)于NSCs組與Hypothermia組的(p＜0.05)。Cylinder te

8、st: NSCs組，Hypothermia組和NSCs+hypothermia組行為學(xué)在細(xì)胞移植后即有改善，但組間的行為學(xué)改善沒(méi)有顯著差異。Morris水迷宮:NSCs+hypothermi組小鼠較Hypothermia組及NSCs組行為學(xué)改善有顯著提高(p＜0.05)。NSCs+hypothermia組移植細(xì)胞的存活率顯著優(yōu)于NSCs組(p＜0.05)。NSCs+hypothermia組的NSCs在細(xì)胞移植后更易于分化為NeuN陽(yáng)性的