神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠腦運(yùn)動(dòng)區(qū)損傷實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦損傷后由于血腦屏障破壞、神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常、炎性介質(zhì)積聚和腦微循環(huán)障礙導(dǎo)致腦功能缺失。既往治療多側(cè)重于從一個(gè)或多個(gè)方面阻斷病變進(jìn)展。胚胎發(fā)生學(xué)的研究提示任何神經(jīng)細(xì)胞群的建立和功能維持均依賴于細(xì)胞內(nèi)外多種特異性信號(hào)的相互作用，這些信號(hào)包括多種生長因子、營養(yǎng)因子和神經(jīng)細(xì)胞之間的突觸聯(lián)系。因此，改變腦局部微環(huán)境，增加細(xì)胞保護(hù)和修復(fù)性因子的表達(dá)成為治療研究方向。晚近開展了直接向損傷腦區(qū)注射治療性藥物和使用胚胎腦組織或基因修飾細(xì)胞移植到損傷腦區(qū)等

2、一系列研究取得了階段性成果，但由于胚胎組織來源不足和面臨倫理學(xué)方面的制約使研究進(jìn)展緩慢。神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcellsNSCs)的發(fā)現(xiàn)和其特有的生物學(xué)性狀為這些問題的解決提供了可能。做為細(xì)胞移植源，補(bǔ)充、替代腦損傷區(qū)缺失細(xì)胞和改變腦局部微環(huán)境激活內(nèi)源性NSCs，重建神經(jīng)環(huán)路，或者通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將編碼神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因片段導(dǎo)入NSCs，再將NSCs移植入腦損傷區(qū)充當(dāng)基因治療的載體，修復(fù)缺失的腦功能，為腦損傷的治療展現(xiàn)出廣闊的

3、應(yīng)用前景。但目前這一切研究仍處于探索階段，還有許多問題亟待于解決和闡明：①損傷后腦內(nèi)神經(jīng)元缺失、軸突脫髓鞘和膠質(zhì)瘢痕形成的病理生理過程②NSCs的本質(zhì)③充足的NSCs的來源④NSCs在腦內(nèi)的遷移和定向分化⑤NSCs的控制分化基因以及轉(zhuǎn)基因后的調(diào)控和滅活等。針對(duì)上述問題，本實(shí)驗(yàn)以Sprague-Daeley(SD)大鼠為研究對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探索。 1建立神經(jīng)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、鑒定和凍存及復(fù)蘇技術(shù)，觀察神經(jīng)干細(xì)胞的生長、增殖和分化特

4、點(diǎn)：SD孕鼠剖腹取胎后，分離胎鼠大腦皮層及皮層下組織，經(jīng)胰酶消化和機(jī)械吹打兩種方法分離細(xì)胞懸液后，用懸浮培養(yǎng)方法，在改良的NSCs培養(yǎng)液中細(xì)胞擴(kuò)增，可以大量獲得生長狀態(tài)良好的NSCs克隆球；采用有限稀釋法，單克性培養(yǎng)也得到一定數(shù)量來源于同一細(xì)胞的亞細(xì)胞系克?。挥妹庖呒?xì)胞化學(xué)方法，鑒定NSCs性狀及其分化能力；觀察凍存NSCs復(fù)蘇后的存活能力和生物學(xué)特性。研究發(fā)現(xiàn)SD胎鼠腦皮層及皮層下腦組織內(nèi)均含有大量NSCs，經(jīng)原代和傳代培養(yǎng)后可以形成

5、細(xì)胞克隆球，在保持NSCs性狀的同時(shí)并具有很強(qiáng)的增殖能力；免疫細(xì)胞化學(xué)染色保持神經(jīng)上皮源性干細(xì)胞標(biāo)記nestin抗體(+)；單細(xì)胞來源的克隆球能分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。NSCs凍存液使用N2完全培養(yǎng)液/胎牛血清/二甲基亞砜=7/2/1比例的冷凍保護(hù)劑，于-180℃中凍存后，復(fù)蘇時(shí)先加入含10％胎牛血清的培養(yǎng)液共培養(yǎng)過渡3小時(shí)后，再更換為無血清NSCs完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察凍存復(fù)蘇后細(xì)胞的活力、形態(tài)、分化能

6、力及特異性抗原的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)凍存時(shí)間對(duì)凍存后細(xì)胞存活率沒有明顯影響，并且能夠保持其原有的生物學(xué)特性。 2觀察以復(fù)制缺陷型腺病毒(replicationdeficientadenoviralvectors，AdVec)介導(dǎo)外源基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)轉(zhuǎn)染NSCs，檢測(cè)真核表達(dá)載體對(duì)NSCs的轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)：懸浮培養(yǎng)NSCs，擴(kuò)增并鑒定腺病毒表達(dá)載體Ad-EGF

7、P，獲得含EGFP的病毒液，感染NSCs，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后6小時(shí)，熒光蛋白開始表達(dá)，48小時(shí)達(dá)高峰，1個(gè)月后仍可觀察到表達(dá)，轉(zhuǎn)染率約76.2％。 3觀察AdVec-EGFP轉(zhuǎn)染NSCs移植入腦損傷區(qū)后的存活、遷移和分化：制作SD大鼠腦運(yùn)動(dòng)皮層損傷模型，定位損傷腦運(yùn)動(dòng)皮層fr1及fr3區(qū)后，向腦損傷區(qū)移植表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(EGFP)的NSCs，不同時(shí)間點(diǎn)熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞存活、遷移和分化，發(fā)

8、現(xiàn)移植后NSCs可以在損傷區(qū)內(nèi)存活1月以上，并向損傷區(qū)外彌漫遷移，腦損傷區(qū)神經(jīng)上皮源性干細(xì)胞標(biāo)記nestin抗體(+)表達(dá)率增加。 4觀察NSCs移植入腦損傷區(qū)后對(duì)病灶及周圍細(xì)胞凋亡率的影響：制作SD大鼠腦運(yùn)動(dòng)皮層損傷模型，定位損傷腦運(yùn)動(dòng)皮層fr1及fr3區(qū)后造成大鼠左后肢癱瘓，損傷后不同時(shí)間點(diǎn)向損傷區(qū)移植外源性NSCs，觀察腦運(yùn)動(dòng)皮層損傷的肢體活動(dòng)障礙的變化，并使用流式細(xì)胞術(shù)和原位末端標(biāo)記DNA片段(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

9、，發(fā)現(xiàn)外源性NSCs移植入腦損傷區(qū)可以縮短大鼠腦功能缺失期并明顯降低腦局部凋亡細(xì)胞發(fā)生率。 5觀察NSCs移植入腦損傷區(qū)后對(duì)病灶及周圍細(xì)胞外基質(zhì)的影響：定位制作SD大鼠腦運(yùn)動(dòng)皮層損傷模型，損傷腦運(yùn)動(dòng)皮層fr1及fr3區(qū)后，造成大鼠左后肢癱瘓，損傷后不同時(shí)間點(diǎn)向損傷區(qū)移植外源性NSCs。觀察大鼠腦運(yùn)動(dòng)皮層損傷的肢體活動(dòng)障礙的變化，并使用免疫組織化學(xué)方法觀察外源性NSCs移植對(duì)病灶及周圍細(xì)胞外基質(zhì)～層連蛋白(Laminin，LN)和

10、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)的影響。結(jié)果提示LN表達(dá)增加，有利于移植細(xì)胞的遷移和病灶修復(fù)。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)分離、培養(yǎng)的細(xì)胞在改良培養(yǎng)液中具有自我更新和分化潛能，有很強(qiáng)的增殖能力，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定神經(jīng)上皮源性干細(xì)胞標(biāo)記nestin抗體(+)，屬于神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞；凍存和復(fù)蘇不影響其活力和原有的生物學(xué)特性。腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染NSCs方法效率高、細(xì)胞死亡率低、易成功，是一種理想的基因轉(zhuǎn)染方法。轉(zhuǎn)染后NSCs在損傷腦區(qū)可以存活，遷移，轉(zhuǎn)染并未明