Tmub1基因沉默對(duì)肝硬化大鼠肝部分切除術(shù)后肝再生的影響.pdf

1、肝部分切除術(shù)（Partial hepatectomy，PH）是目前治療各種肝臟良惡性疾病最有效方法，但PH范圍過(guò)大或肝臟本身處于一種嚴(yán)重的病理?xiàng)l件時(shí)易導(dǎo)致肝功能衰竭，這是一個(gè)臨床上非常棘手的問(wèn)題。盡管肝移植術(shù)能夠有效解決該問(wèn)題，但現(xiàn)行醫(yī)療體制下供體匱乏、價(jià)格昂貴等問(wèn)題使得肝移植術(shù)難以廣泛開(kāi)展;而現(xiàn)有生物人工肝技術(shù)尚不成熟，體內(nèi)肝細(xì)胞移植術(shù)治療效果有限。故如何解決該問(wèn)題引起了世界范圍內(nèi)的思考。肝臟再生能力極強(qiáng)，PH術(shù)后肝細(xì)胞能夠迅速的復(fù)制

2、增殖實(shí)現(xiàn)再生，然而目前對(duì)其自身調(diào)控機(jī)制尚不清楚。如果了解其機(jī)制，能夠幫助我們?nèi)斯?chuàng)造良好的肝再生環(huán)境，無(wú)論P(yáng)H范圍的大小或是肝臟處于何等嚴(yán)重的病理?xiàng)l件。因此，探索肝再生自身調(diào)控機(jī)制具有極其重要的臨床意義。
　　本課題組前期研究顯示，Tmub1(transmembrane and ubiquitin—like domaincontaining1)蛋白在肝細(xì)胞增殖進(jìn)程中發(fā)揮了重要的負(fù)向調(diào)控作用。2005年，F(xiàn)azia等學(xué)者首次報(bào)道Tm

3、ub1蛋白，它在肝細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，已知Tmub1蛋白在肝再生過(guò)程和神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)相對(duì)較高，然而其所扮演的角色尚不十分清楚。在肝再生過(guò)程中，Tmub1表達(dá)增高，在該程中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，可以有效防止肝細(xì)胞過(guò)度增殖;在神經(jīng)系統(tǒng)中，Tmub1蛋白高表達(dá)于大腦內(nèi)，利于細(xì)胞表面回收利用AMPAR（α-氨基羥甲基惡唑丙酸受體）亞基GluR2，并且Tmub1蛋白能夠與鈣離子信號(hào)調(diào)節(jié)親環(huán)素配體(Calcium modulating c

4、yclophilin ligand，CAML)相互作用，參與自發(fā)活動(dòng)和覺(jué)醒的調(diào)控。研究結(jié)果表明Tmub1基因及其蛋白在肝再生進(jìn)程中扮演著重要的調(diào)控角色，然而其機(jī)制仍不清楚。
　　研究目的:
　　1、利用慢病毒干擾技術(shù)下調(diào)Tmub1的表達(dá)，觀察其對(duì)正常大鼠PH術(shù)后肝細(xì)胞增殖周期及肝再生的影響;
　　2、分析可能相關(guān)的調(diào)控蛋白，初步探討Tmub1蛋白對(duì)肝細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制;
　　3、了解肝硬化條件下Tmub1蛋白在肝

5、臟中的表達(dá)是否異常，并探討其意義;
　　4、利用慢病毒干擾技術(shù)，分析肝硬化條件下Tmub1蛋白的異常變化對(duì)肝功及肝細(xì)胞增殖的影響，并探討其機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容及方法:
　　1.Tmub1基因沉默對(duì)正常大鼠肝部分切除術(shù)后肝細(xì)胞增殖的影響
　　1.1實(shí)驗(yàn)條件及分組。實(shí)驗(yàn)條件:雄性Sprague-Dawly大鼠（質(zhì)量200～300g）置于標(biāo)準(zhǔn)條件下:12h白晝交替，保持室溫恒定，使大鼠能自由接觸水和食物，保證各組間大鼠

6、的體重及生活習(xí)慣無(wú)明顯差別。將54只大鼠隨機(jī)進(jìn)行分組，其中Tmub1 RNAi實(shí)驗(yàn)組、空載慢病毒組分別通過(guò)腸系膜上靜脈注射相應(yīng)病毒顆粒（慢病毒每0.1ml為一個(gè)注射單位，約3×107TU病毒量，每次注射前用PBS稀釋至10倍），對(duì)照組未行注射操作，2天后行PH術(shù)。每組分為6個(gè)亞組:PH術(shù)后0h、2h、6h、12h、24h、48h，且每亞組含有3只大鼠。術(shù)后留取肝臟組織標(biāo)本、利用原位組織消化法提取的原代肝細(xì)胞。
　　1.2建立大鼠P

7、H術(shù)動(dòng)物模型。
　　1.3原位肝細(xì)胞分離與原代肝細(xì)胞培養(yǎng)。按實(shí)驗(yàn)分組于PH術(shù)后0h、2h、6h、12h、24h、48h分別留取大鼠10g左右肝臟組織，原位消化肝臟，提取原代肝細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞活力，并將肝細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，以便后期MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞增殖周期。
　　1.4 RT-PCR法檢測(cè)Tmub1 mRNA、securin mRNA水平。
　　1.5 Western Blot法檢測(cè)Tmu

8、b1蛋白、securin蛋白表達(dá)情況。
　　1.6噻唑藍(lán)(MTT)試驗(yàn)檢測(cè)各組肝細(xì)胞增殖情況。
　　1.7用流式細(xì)胞儀觀察各組細(xì)胞周期
　　2.Tmub1基因沉默對(duì)肝硬化大鼠肝部分切除術(shù)后肝細(xì)胞增殖的影響
　　2.1實(shí)驗(yàn)條件及分組。實(shí)驗(yàn)條件:雄性Sprague-Dawly大鼠（質(zhì)量200～300g）置于標(biāo)準(zhǔn)條件下:12h晝夜交替，保持室溫恒定，使大鼠能自由接觸水和食物，確保各組大鼠生活環(huán)境無(wú)明顯差異。將9只雄性S

9、D肝硬化大鼠隨機(jī)分組，另有3只正常雄性SD大鼠作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，其中Tmub1 RNAi實(shí)驗(yàn)組、慢病毒空載組通過(guò)腸系膜上靜脈分別注射相應(yīng)病毒（慢病毒每0.1ml為一個(gè)注射單位，約3×107TU病毒量，每次注射前用PBS稀釋至10倍），對(duì)照組無(wú)注射操作，注射慢病毒2天后行PH術(shù)。PH術(shù)后24h，留取肝臟組織及血清標(biāo)本。
　　2.2 SD大鼠肝硬化動(dòng)物模型的建立。取雄性SD大鼠20只，體重180-200g。于SD大鼠頸、背部皮下注射99

10、.9％的CCl4（首劑0.5mL/100g體重），以后每周兩次皮下注射40％ CCl4油劑（將99.9％分析純CCl4與花生油按4∶6比例混合），劑量為0.3mL/100g體重，并允其自由飲用自來(lái)水、進(jìn)食高脂飼料，共6周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成模的標(biāo)準(zhǔn):隨機(jī)取3只大鼠剖腹取適量肝組織做活檢以確定是否形成肝硬化，即肉眼直視下有硬化結(jié)節(jié)形成，組織切片HE染色見(jiàn)肝小葉結(jié)節(jié)紊亂和假小葉形成。
　　2.3 SD大鼠PH術(shù)動(dòng)物模型的建立。
　　2.

11、4肝功能檢測(cè)以了解肝硬化程度、肝功能狀態(tài)。
　　2.5 Ki67免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞增殖狀態(tài)。
　　2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)不同條件下Tmub1蛋白水平。
　　2.7 Q-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)條件下Tmub1 mRNA、IGF1 mRNA、HGFmRNA、TGF-β1 mRNA、C/EBP-βmRNA、STAT3 mRNA、WT-1 mRNA水平差異。
　　結(jié)果:
　　1.Tmu

12、b1基因沉默對(duì)正常大鼠肝部分切除術(shù)后肝細(xì)胞增殖的影響
　　1.1 Tmub1 RNAi的干擾效果檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組Tmub1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(p＜0.05)。
　　1.2 Tmub1沉默對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，于PH術(shù)后6h、12h、24h提取的肝細(xì)胞經(jīng)過(guò)相同培養(yǎng)時(shí)間后，Tmub1 RNAi實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞明顯較另兩組細(xì)胞量多，間接反映增殖速率快。上述結(jié)果證明，Tmub1的下調(diào)可明顯上調(diào)PH術(shù)后6h-24h

13、肝細(xì)胞的增殖速率。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組處于G2/M期的肝細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　1.3 Tmub1沉默后對(duì)securin mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。在Tmub1沉默后，securinmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，而G2/M期securin蛋白量明顯降低。這說(shuō)明Tmub1的沉默未影響securin蛋白的基因轉(zhuǎn)錄（即未影響securin蛋白的合成），而是加速了securin蛋白的降解。

14、>　　2.Tmub1基因沉默對(duì)肝硬化大鼠肝部分切除術(shù)后肝細(xì)胞增殖的影響
　　2.1肝硬化大鼠病理學(xué)觀察。顯微鏡下，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維結(jié)締組織異常增生，廣泛假小葉形成。
　　2.2 Tmub1 RNAi干擾效果檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組Tmub1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(p＜0.05)。
　　2.3 Western blot及Q-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)正常大鼠與肝硬化大鼠Tmub1蛋白表達(dá)情況。肝硬化大鼠Tmub1基因水平及蛋

15、白水平較正常大鼠均顯著增高。
　　2.4不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖赂喂δ懿町悪z測(cè)。Tmub1 RNAi組大鼠的肝功能較肝硬化組及慢病毒空載組大鼠的肝功能顯著好轉(zhuǎn)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，n=3，p＜0.05。
　　2.5 Ki-67免疫組化方法檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖赂渭?xì)胞增殖狀態(tài)情況。通過(guò)Tmub1RNAi干擾技術(shù)下調(diào)Tmub1的表達(dá)后，其Ki-67陽(yáng)性率有明顯上調(diào)（與肝硬化組及慢病毒空載組比較），表明肝硬化條件下，Tmub1的下調(diào)能夠有效促進(jìn)PH

16、術(shù)后的肝細(xì)胞再生。
　　2.6 Q-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖翴GF1 mRNA、HGF mRNA、TGF-βmRNA、C/EBP-βmRNA、STAT3 mRNA、WT-1 mRNA水平差異。本肝硬化模型下IGF1mRNA，HGF mRNA，TGF-β1 mRNA，C/EBP-βmRNA，WT-1 mRNA顯著增多，STAT3mRNA則明顯下調(diào)，各因子的變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，b:與正常組比較，n=3，p＜0.05;通過(guò)Tmu

17、b1 RNAi技術(shù)下調(diào)Tmub1表達(dá)后，IGF1 mRNA，HGF mRNA，TGF-β1 mRNA，C/EBP-βmRNA，WT-1 mRNA均有明顯下降（趨近于正常組水平），STAT3則有顯著上調(diào)（趨近于正常組水平），各因子的變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1慢病毒載體適用于目的基因的RNA干擾實(shí)驗(yàn)，并且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中亦能發(fā)揮較好的效果。
　　2 Tmub1蛋白可能在肝細(xì)胞增殖周期G2/M期發(fā)揮重要作用。

18、>　　3 Tmub1蛋白在肝再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用可能與其在蛋白質(zhì)水平影響了Securin的表達(dá)密切相關(guān)。
　　4肝硬化大鼠Tmub1蛋白表達(dá)水平較正常大鼠顯著增高。
　　5 Tmub1的下調(diào)能夠改善肝硬化大鼠PH術(shù)后肝功能狀態(tài)及肝細(xì)胞增殖情況。
　　6四氯化碳致輕中度肝硬化模型下，IGF1 mRNA、HGF mRNA、C/EBP-βmRNA、TGF-β1 mRNA、WT-1 mRNA顯著增多，STAT3則明顯下調(diào)。通