論文一CAP對白血病細(xì)胞及白血病多藥耐藥細(xì)胞的體外體內(nèi)作用的研究;論文二Endostatin聯(lián)合治療非霍奇金惡性淋巴瘤的體內(nèi)研究.pdf

1、研究背景 多藥耐藥(multi-drug resistance MDR)是腫瘤以及白血病治療失敗的主要原因，多年來一直困擾臨床血液及腫瘤工作者。多藥耐藥產(chǎn)生的機(jī)制是復(fù)雜的，除有藥物外排泵作用、細(xì)胞內(nèi)解毒酶機(jī)制加強(qiáng)、DNA修復(fù)功能加強(qiáng)外，耐藥細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制是不容忽視的。多藥耐藥蛋白P-gp和MRP是ABC家族成員，在細(xì)胞膜形成ATP依賴的蛋白通道將藥物排出細(xì)胞外，保護(hù)細(xì)胞免受藥物攻擊，P-gp還具有抑制caspase-8活化、阻斷cas

2、pase(caspase-dependent apoptosis)途徑凋亡的作用。目前耐藥逆轉(zhuǎn)策略主要是針對耐藥發(fā)生機(jī)制的位點(diǎn)，但是因?yàn)樗幬锏亩靖弊饔没蚰退帣C(jī)制的復(fù)雜性尚未解決臨床問題。 氯霉素(chloramphenicol CAP)是一種小分子脂溶性物質(zhì)，因?qū)?xì)菌S亞基的抑制作用應(yīng)用于臨床，是線粒體蛋白質(zhì)合成抑制劑，具有損傷骨髓造血細(xì)胞、抑制造血功能特點(diǎn)。在本研究中發(fā)現(xiàn)CAP具有抑制血液腫瘤細(xì)胞生長的作用，對白血病多

3、藥耐藥細(xì)胞作用較敏感細(xì)胞更強(qiáng)，因此設(shè)想通過對CAP作用機(jī)制的研究來探討克服白血病多藥耐藥的途徑，通過研究的逐步進(jìn)行及各種研究文獻(xiàn)的復(fù)習(xí)，發(fā)現(xiàn)直接損傷細(xì)胞的能量中心及誘發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵部位線粒體，能阻斷細(xì)胞能量來源并誘發(fā)細(xì)胞凋亡，從而繞過線粒體以上耐藥機(jī)制位點(diǎn)，達(dá)到殺滅耐藥腫瘤細(xì)胞的目的。 研究目的 1、觀察CAP體外抑制血液腫瘤生長作用及對白血病細(xì)胞及白血病多藥耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期影響。2、探討CAP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用及凋亡途徑。

4、3、觀察CAP引起K562、K562/A02細(xì)胞線粒體損傷的超微結(jié)構(gòu)變化及線粒體膜電位改變。4、觀察CAP對K562/A02多藥耐藥細(xì)胞的細(xì)胞膜外排泵作用的影響，及對K562/A02細(xì)胞P-gp表達(dá)的作用。5、觀察CAP對不同組織來源細(xì)胞作用的差異，判斷CAP作用是否具有組織特異性。6、建立K562白血病細(xì)胞及K562/A02多藥耐藥細(xì)胞同鼠移植模型，觀察CAP對白血病細(xì)胞及白血病多藥耐藥細(xì)胞的體內(nèi)作用。本研究初步觀察線粒體抑制劑CA

5、P對白血病細(xì)胞及白血病細(xì)胞多藥耐藥細(xì)胞的作用，探討線粒體損傷克服白血病多藥耐藥的作用。 研究方法 1、觀察CAP對白血病細(xì)胞及白血病多藥耐藥細(xì)胞的體外作用 1．1 用MTT方法測定CAP體外抗腫瘤活性，觀察CAP對白血病細(xì)胞的生長抑制作用 1．2 觀察CAP對白血病細(xì)胞周期的影響 K562、K562/A02、HL60、HL60/ADR細(xì)胞系經(jīng)予CAP處理后，行PI染色，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期檢

6、測分析。 1．3 確定細(xì)胞凋亡 (1) 用Annexin-V檢測試劑盒對CAP處理的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記， 流式細(xì)胞術(shù)檢測早期凋亡細(xì)胞率 (2) 瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡細(xì)胞的DNA條帶。 1．4 判斷CAP誘導(dǎo)凋亡的途徑 用Western blot方法觀察經(jīng)CAP處理后，K562、K562/A02細(xì)胞系細(xì)胞色素-C自線粒體向細(xì)胞漿的釋放；用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活化的caspas

7、e-3、8、9，同時觀察caspase途徑廣泛阻斷劑Z-VAD-fmk對caspase-3、8、9的阻斷作用，以確定CAP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑。 1．5 觀察CAP作用后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 用透射電子顯微鏡觀察CAP處理后K5 62、K562/A02、HL60及HL60/ADR細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化；用羅丹明作為線粒體標(biāo)記物，共聚焦顯微鏡觀察線粒體熒光變化，流式細(xì)胞術(shù)同步測定胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，以確定線粒體活性變化。 1

8、．6 線粒體膜電位測定 用JC-1標(biāo)記線粒體，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，判斷CAP作用前后線粒體膜電位變化。 1．7 CAP對P-gp藥物外排泵功能的影響 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測 CAP作用后耐藥細(xì)胞K562/A02對Rhodanminl 23攝取率及ADR攝取率的變化，觀察CAP對K562/A02細(xì)胞膜的藥物外排泵的作用。 2、觀察CAP對K562、K562/A02白血病細(xì)胞的體內(nèi)作用

9、 建立人類K562、K562/A02白血病細(xì)胞同鼠移植模型，分組應(yīng)用CAP、DNR治療，設(shè)立陰性治療對照組，觀察治療后腫瘤體積變化及體重變化，并檢測腫瘤細(xì)胞凋亡率，同時觀察移植瘤和組織臟器病理形態(tài)改變。 研究結(jié)果 1、CAP對血液腫瘤細(xì)胞具有生長抑制作用及周期抑制作用，此作用具有時間依賴性及劑量依賴性；CAP使細(xì)胞阻滯于G0-G1期，S期細(xì)胞減少。 2、CAP誘導(dǎo)K562、K562/A02、HL60、

10、HL60/ADR細(xì)胞凋亡，25 μg/ml CAP作用24小時即可觀察到早期凋亡，50 μ g/ml CAP作用72小時出現(xiàn)DNA凋亡條帶。 3、CAP促進(jìn)細(xì)胞色素-C釋放及促caspase-9、caspase-3活化，而對caspase-8活化無作用，caspase阻斷劑ZAVD-FMK不能完全阻斷caspase-9、caspase-3的釋放，顯示CAP通過caspase非依賴途徑(caspase-independent

11、pathway)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 4、電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，CAP作用后K562、K562/A02細(xì)胞線粒體腫脹，呈花瓣樣及車輪樣變；K562/A02細(xì)胞線粒體空泡樣變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、增殖，并出現(xiàn)線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合現(xiàn)象。 5、共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體熒光強(qiáng)度的變化：經(jīng)’Verapamia阻斷細(xì)胞膜P-gp功能后耐藥細(xì)胞熒光強(qiáng)度較敏感細(xì)胞增強(qiáng)；25 μ g/mlCAP作用12小時，K562、K562/A025細(xì)胞熒光強(qiáng)度

12、有所增加； 50 μg/m1CAP作用后細(xì)胞熒光強(qiáng)度減弱。說明耐藥細(xì)胞較敏感細(xì)胞線粒體分布或活性增強(qiáng)，CAP可以使線粒體功能發(fā)生改變。同步流式細(xì)胞儀對胞內(nèi)Rho 123熒光強(qiáng)度檢測提示，在一定的條件下，CAP改變耐藥細(xì)胞膜的外排功能，當(dāng)超過一定濃度線粒體受損傷。 6、50 μg/ml CAP作用K562、K562/A02細(xì)胞1 2小時后，用線粒體標(biāo)記探針JC-1進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果證實(shí)，在細(xì)胞凋亡前CAP誘導(dǎo)線粒

13、體膜電位下降。 7、流試細(xì)胞術(shù)對K562/A02胞內(nèi)藥物濃度檢測顯示，CAP可促進(jìn)K562/A02細(xì)胞對阿霉素及羅丹明攝取率。 8、CAP對K562、K562/A02移植瘤有抑制作用，對K562/A02移植瘤抑制作用較K562移植瘤顯著。CAP誘發(fā)K5 62/A02細(xì)胞凋亡及病理形態(tài)死亡。 9、CAP對乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，口腔癌KB細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞系EvC抑制作用較血液腫瘤明顯減低，其IC50值達(dá)

14、150mg/L以上，無臨床作用意義。 結(jié)論 1、CAP對多種血液腫瘤細(xì)胞具有生長抑制作用及周期阻止作用。2、25-50mg/L CAP作用24小時可出現(xiàn)K562、K562/A02、HL60、HL60/ADR白血病細(xì)胞凋亡，CAP通過促進(jìn)細(xì)胞色素-C釋放、caspase-3及caspase-9活化、線粒體膜電位下降，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞通過線粒體途徑凋亡。3、K562/A02細(xì)胞線粒體較K562細(xì)胞豐富，線粒體活性增強(qiáng)。CAP

15、可引起K562、K562/A02細(xì)胞線粒體腫脹、車輪樣變，而K562/A02細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體融合現(xiàn)象。4、CAP具有抑制MDR細(xì)胞膜的藥物外排作用。5、CAP具有體內(nèi)抑制K562/A02及K562移植瘤生長作用，在一定的用藥范圍內(nèi)無明顯毒副作用。6、初步觀察CAP對部分髓外細(xì)胞系無臨床意義的生長抑制作用。 研究意義 白血病多藥耐藥一直是血液腫瘤界需要解決的臨床問題，人們通過對大量的基礎(chǔ)及臨床研究，探討

16、耐藥機(jī)制，尋找耐藥逆轉(zhuǎn)策略，但目前臨床應(yīng)用中有各種不足。目前己發(fā)現(xiàn)耐藥基因的作用可能是多元性的，單一的阻斷某一位點(diǎn)可能不能完全阻斷耐藥的作用。我們通過本研究發(fā)現(xiàn)，線粒體損傷不但能阻斷多藥耐藥細(xì)胞ATP供能，增加胞內(nèi)的藥物濃度，并且誘導(dǎo)白血病多藥耐藥細(xì)胞凋亡，是克服白血病多藥耐藥的一個有效治療靶點(diǎn)。1、此研究首次進(jìn)行線粒體蛋白抑制劑CAP對白血病多藥耐藥細(xì)胞作用的研究，并證實(shí)體內(nèi)體外對白血病多藥耐藥細(xì)胞作用的有效性。2、證實(shí)CAP通過線粒

17、體途徑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞及多藥耐藥細(xì)胞凋亡。3、透射電鏡下觀察CAP作用后K562細(xì)胞與K5 62/A02細(xì)胞線粒體的變化，及他們之間的差異。并觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體融合的結(jié)構(gòu)，提示CAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要是線粒體損傷，也可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡有關(guān)。4、首次在共聚焦顯微鏡下觀察CAP作用后K562與K562/A02細(xì)胞線粒體的變化，以及他們之間的差異。提示敏感細(xì)胞與耐藥細(xì)胞之間線粒體的差異可能決定了細(xì)胞對CAP敏感性，是線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡的基