刺參多肽影響NIH-3T3細(xì)胞增殖及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、在機(jī)體的衰老過(guò)程中，皮膚的衰老最為明顯。隨著年齡的增長(zhǎng)，皮膚的真皮層會(huì)變薄、彈性會(huì)降低，還會(huì)產(chǎn)生干燥、色斑、皺紋、松弛、下垂等一系列癥狀。膠原蛋白含量的減少及成纖維細(xì)胞增殖率的降低是引起皮膚衰老的主要原因。
　　刺參(Stichopus japonicas)屬于棘皮動(dòng)物門(mén)，海參綱，刺參科。研究表明海參酶解物能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其單一活性成分未能確定。因此，本文以新鮮刺參為原料，以小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3細(xì)胞株為研究對(duì)象，

2、對(duì)新鮮刺參體內(nèi)的促細(xì)胞增殖成分進(jìn)行了分離純化，以篩選活性最強(qiáng)的組分，并探索其促進(jìn)膠原蛋白表達(dá)的作用機(jī)制。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果如下。
　　1、活性成分SP12的分離純化
　　實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)刺參酶解提取物作用于NIH/3T3細(xì)胞后的細(xì)胞存活率，并結(jié)合得率來(lái)篩選促增殖活性較高的多肽成分。分離純化過(guò)程為:制備勻漿，復(fù)合酶酶解，MTT法檢測(cè)其細(xì)胞活性，然后經(jīng)DEAE陰離子交換層析，S200凝膠層析，G10脫鹽等過(guò)程得到一個(gè)具有較強(qiáng)

3、促增殖活性的單一多肽，即SP12。對(duì)該多肽進(jìn)行性質(zhì)檢測(cè)，超低分子量蛋白電泳分析得到其分子量約為3.87kDa，高效液相色譜檢測(cè)其純度為97.4％。
　　2、SP12對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及膠原蛋白分泌的影響
　　采用MTT法檢測(cè)SP12對(duì)NIH/3T3細(xì)胞的增殖作用;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SP12對(duì)成纖維細(xì)胞周期的影響;使用羥脯氨酸測(cè)定試劑盒的方法檢測(cè)SP12對(duì)成纖維細(xì)胞膠原蛋白分泌的影響。結(jié)果表明SP12能顯著提高成纖維細(xì)

4、胞的增殖率，促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變，增加細(xì)胞膠原蛋白的表達(dá)量，且在0-20μg/mL濃度范圍內(nèi)均具有劑量依賴(lài)性。
　　3、SP12對(duì)NIH/3T3細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白、MMP-1及TIMP-1表達(dá)的影響
　　采用Western Blot及RT-PCR的方法，在蛋白水平及轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)SP12對(duì)NIH/3T3細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白、MMP-1及TIMP-1表達(dá)的影響。結(jié)果表明，無(wú)論在蛋白水平還是在轉(zhuǎn)錄水平，SP12均能顯著促進(jìn)Ⅰ型膠