STK15的表達(dá)對(duì)NIH3T3細(xì)胞的影響及STK15轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立.pdf

1、目的： STK15基因是絲/蘇氨酸激酶家族成員之一，STK15基因在多種惡性腫瘤組織中都具有高表達(dá)，其擴(kuò)增和高表達(dá)能引起中心體復(fù)制擴(kuò)增，染色體不穩(wěn)定性增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，從而誘發(fā)惡性腫瘤?，F(xiàn)階段國內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)STK15基因的功能在細(xì)胞水平的報(bào)道還很少，為了進(jìn)一步研究STK15基因與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)利用pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞NIH3T3，觀察STK15高表達(dá)對(duì)NIH3T3細(xì)胞的

2、影響，并通過顯微注射法，制備攜帶STK15的轉(zhuǎn)基因小鼠，為研究該基因在惡性腫瘤中的作用，提供了很好的動(dòng)物模型。 方法： 首先提取人胚肺細(xì)胞總RNA作為模版，根據(jù)GenBank中STK15基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出1200bp的STK15基因全長，克隆到pTZ57R/T載體，通過測序證實(shí)序列的正確性。用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切空載體pcDNA3.1和pTZ57R/T-STK15連接產(chǎn)物，然后回收、

3、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，從而成功構(gòu)建了pcDNA3.1-STK15表達(dá)質(zhì)粒。然后將pcDNA3.1-STK15表達(dá)質(zhì)粒體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3，以轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的NIH3T3細(xì)胞作對(duì)照，應(yīng)用RT-PCR方法分析STK15在RNA水平的表達(dá)；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和Western印跡方法分析STK15在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)；應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力；應(yīng)用重組人工基底膜(Transw

4、ell)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力。同時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行超排獲得原核期胚胎，將構(gòu)建的pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒用BglⅡ和Bst1107 Ⅰ雙酶切，獲取目的基因片段，應(yīng)用顯微注射法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，對(duì)新生小鼠通過提取鼠尾基因組DNA、進(jìn)行PCR和Southern blot方法鑒定。通過提取PCR陽性的轉(zhuǎn)基因鼠的RNA，應(yīng)用RT-PCR方法分析STK15基因在轉(zhuǎn)基因陽性小鼠各組織的轉(zhuǎn)錄特征和表達(dá)情況。 結(jié)果： 重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測

5、序等分析插入的基因片段為表達(dá)STK15的基因，說明成功構(gòu)建了pcDNA3.1-STK15表達(dá)質(zhì)粒。然后，用脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠的成纖維細(xì)胞NIH3T3，在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用RT-PCR的方法檢測到STKl5mRNA的轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步用Westem和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測到STK15的蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，說明轉(zhuǎn)染成功。與轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的NIH3T3細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)

6、粒的NIH3T3細(xì)胞48小時(shí)的MTT攝取率顯著升高(P<0.05)；Trans-well方法檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的NIH3T3細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞穿透Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)明顯增多，說明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)。轉(zhuǎn)基因小鼠制備實(shí)驗(yàn)，共注907枚受精卵，存活701枚，注射成功率為77％，分別移入30只小鼠輸卵管，共產(chǎn)出106

7、只F0代轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR檢測轉(zhuǎn)基因陽性鼠為3只，Southern雜交檢測轉(zhuǎn)基因陽性鼠一只。將轉(zhuǎn)基因陽性鼠與正常C57BL/6交配，產(chǎn)生F1代陽性鼠2只：將F1代陽性鼠與正常C57BL/6交配，產(chǎn)生F2代鼠3只。通過提取PCR檢測陽性的F0代轉(zhuǎn)基因小鼠的RNA，應(yīng)用RT-PCR的方法檢測到在轉(zhuǎn)基因小鼠的睪丸組織能夠轉(zhuǎn)錄出STK15mRNA。 結(jié)論： pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，可以有效地