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文檔簡介
1、研究背景和研究目的: 據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),肺癌是當(dāng)今世界上最大的癌患,其死亡率居于各種惡性腫瘤之首位,中國也已成為世界上第一肺癌大國。按組織學(xué)類型可將肺癌分為兩大類:小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%以上。由于非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移后禁忌手術(shù),且對放療很不敏感,因此,對非小細(xì)胞肺癌化療藥物的開發(fā)與研究尤為重要。 肺癌化療的常用藥物有如下五類:直接破壞DNA藥物、插入DNA模板藥物、影響核酸合成藥物、抑
2、制微管裝配藥物、影響蛋白質(zhì)合成藥物五類。盡管上述藥物可有效誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡,但是毒副作用較大且容易引起耐藥,從而導(dǎo)致化療失敗。因此,開發(fā)毒性小、副作用少、能克服多藥耐藥和有效啟動肺癌細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑的藥物是目前亟待解決的問題。 本研究選用H460、A549、H1792、H226、WI38細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究有機(jī)錫小分子化合物抑制NSCLC細(xì)胞生長的機(jī)制,原因在于:1)此四種NSCLC細(xì)胞分別來源于腺癌、大細(xì)胞癌、鱗癌,涵蓋了非
3、小細(xì)胞肺癌的三種亞型;2)此四種NSCLC細(xì)胞均可單獨(dú)作為非小細(xì)胞肺癌研究領(lǐng)域里的模式細(xì)胞,用于細(xì)胞水平的檢測;3)迄今對有機(jī)錫小分子化合物誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究還比較少;4)WI38細(xì)胞是從人胚肺組織建立的二倍體成纖維細(xì)胞系,作為正常細(xì)胞經(jīng)常被用作肺癌研究的對照細(xì)胞。因此可用以上細(xì)胞系篩選小分子化合物,并對其機(jī)制做深入研究,為NSCLC化療藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。 化學(xué)遺傳學(xué)(chemical genetics)是利
4、用化學(xué)工具來研究生物體系的一種新興手段,其可以在以下兩個重要方面促進(jìn)新藥開發(fā):一方面是鑒定出在某種疾病形成過程中起重要作用的基因或蛋白質(zhì),從而為新藥篩選提供靶點(diǎn);另外一方面是發(fā)現(xiàn)特異性作用于某個基因或蛋白質(zhì)的小分子化合物,從而為新藥開發(fā)提供先導(dǎo)化合物?;瘜W(xué)遺傳學(xué)應(yīng)用的關(guān)鍵之一是要有大量的可供篩選的不同結(jié)構(gòu)的化合物,新興的組合化學(xué)很好地解決了這一難題,在同一個化學(xué)反應(yīng)體系中加入不同結(jié)構(gòu)單元,利用這些結(jié)構(gòu)單元的排列組合,就能夠系統(tǒng)地合成大量
5、化合物。近年來,化學(xué)遺傳學(xué)在細(xì)胞凋亡研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用:美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院袁鈞瑛教授帶領(lǐng)課題組進(jìn)行了“用小分子研究細(xì)胞死亡過程中的信號傳導(dǎo):從Bcl-2到程序性壞死”的研究;美國密執(zhí)安大學(xué)癌癥中心王少萌教授開展了“合理設(shè)計(jì)小分子拮抗劑來調(diào)控關(guān)鍵性細(xì)胞壞死和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用”的研究;另外,美國國立癌癥研究所(NCI)早在1997年啟動了一項(xiàng)新計(jì)劃,將化學(xué)遺傳學(xué)應(yīng)用到癌癥治療研究中,即利用細(xì)胞滲透性的小分子化合物觸發(fā)腫瘤細(xì)胞
6、死亡。這充分說明化學(xué)遺傳學(xué)方法為細(xì)胞凋亡研究提供了一個可靠的平臺,基于此平臺,利用具有一定生物活性的小分子化合物作為研究手段來研究細(xì)胞凋亡過程中的信號傳導(dǎo),優(yōu)勢明顯:小分子化合物易于進(jìn)入細(xì)胞,易于引起細(xì)胞表型變化,其作用具有劑量依賴性,適用于多蛋白家族,不會引起細(xì)胞的適應(yīng)性變化等,另外,這些小分子化合物還往往可以作為“先導(dǎo)化合物”,進(jìn)而指導(dǎo)新藥的開發(fā)研究。 近幾年來,本課題組一直在從事有機(jī)小分子化合物庫的構(gòu)建工作,目前,庫中已包
7、含了60余種有機(jī)錫小分子化合物。研究顯示,某些有機(jī)錫化合物具有抗腫瘤活性,這已經(jīng)在MCF-7(乳腺癌)、WiDr(結(jié)腸癌)、P388(小鼠白血?。┑瓤拱┗钚匝芯恐械玫阶C實(shí)。這些研究大都停留在生長抑制實(shí)驗(yàn)階段,部分研究顯示有機(jī)錫化合物可以阻滯腫瘤細(xì)胞周期,但對其抑制生長、誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制仍然不清楚。因此,探討有機(jī)錫小分子化合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡分子機(jī)制具有重要意義。 基于以上考量,本課題研究目的是:利用化學(xué)遺傳學(xué)這一新興技術(shù)平臺,以
8、非小細(xì)胞肺癌H460、A549、H1792和H226細(xì)胞為研究對象,對草酰腙縮乙醛酸三環(huán)己基錫酯(OGTCT)的體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究,進(jìn)而探討其誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,為新型肺癌化療藥物的開發(fā)提供更加完善的理論依據(jù)。 研究內(nèi)容: 1.鑒定OGTCT對NSCLC細(xì)胞、耐藥細(xì)胞H460/TaxR及人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞WB8的生長抑制作用。 2.探討OGTCT對H460細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。 3.分析
9、OGTCT對H460細(xì)胞周期分布及周期調(diào)控相關(guān)蛋白p53、p21、PCNA表達(dá)的影響。 4.分析OGTCT誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡過程中,凋亡相關(guān)調(diào)控因子的變化及重要凋亡通路的激活情況。 研究方法: 1細(xì)胞生長抑制檢測: 1.1 MTT法檢測細(xì)胞存活率,由此對OGTCT進(jìn)行初步篩選: 1.2選擇目前臨床上常用抗腫瘤藥物紫杉醇(Paclitaxel)為對照藥物,用MTT法檢測其對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的生
10、長抑制情況,并與OGTCT做比較。 2.細(xì)胞凋亡檢測方法: 2.1倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及凋亡小體; 2.2 Hoechst33258熒光染色,并結(jié)合熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化; 2.3乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測細(xì)胞是否出現(xiàn)壞死; 2.4臺盼藍(lán)拒染法進(jìn)一步檢測細(xì)胞是否出現(xiàn)壞死; 2.5用Nucleosome ELISA試劑盒檢測細(xì)胞凋亡率。 3.細(xì)胞周期及其相關(guān)調(diào)控
11、蛋白表達(dá)變化的檢測: 3.1流式細(xì)胞技術(shù)檢測OGTCT對細(xì)胞周期分布的影響; 3.2酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)(ELISA)檢測與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)重要蛋白p53和p21的表達(dá)變化; 3.3免疫熒光結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測增殖細(xì)胞核抗原PCNA的表達(dá)及分布; 3.4 Western blot檢測p53蛋白的表達(dá)。 4.熒光探針結(jié)合激光掃描共聚焦技術(shù)檢測細(xì)胞中鈣離子濃度變化。 5.檢測OGTCT
12、對ICE家族蛋白酶成員激活情況,方法如下: 5.1用ApoAlert caspase-3,-8比色檢測試劑盒分析caspase-3,-8酶活性變化; 5.2用ApoAlert caspase9/6熒光檢測試劑盒分析caspase-9/6酶活性變化; 5.3用caspase抑制劑檢測caspase-3,8,6,9對OGTCT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。 6.免疫熒光結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測抗凋亡蛋白Bcl-
13、2的分布及表達(dá)。 7.Western blot檢測細(xì)胞色素C(Cyto-C)的表達(dá)變化。 8.酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒檢測Fas/FasL的表達(dá)變化。 研究結(jié)果: 1.OGTCT抗腫瘤活性檢測結(jié)果(MTT法檢測細(xì)胞存活率)。 2.OGTCT誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果。 2.1倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 3.OGTCT對H460細(xì)胞周期的影響及相關(guān)分子機(jī)制研究結(jié)果。
14、 4.OGTCT誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子機(jī)制研究結(jié)果。 結(jié)論: 1.OGTCT以濃度依賴的方式,顯著降低NSCLC和H460/TaxR細(xì)胞的存活率。OGTCT與紫杉醇相比優(yōu)勢明顯:對正常細(xì)胞WI38的毒性極小,且能有效克服腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。 2.OGTCT能有效誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡。OGTCT可能通過上調(diào)p53和p21蛋白水平、降低PCNA表達(dá)的方式將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期、下調(diào)Bcl-2蛋白表
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