淀粉液化芽孢桿菌ES-2-4基因組改組提高脂肽產(chǎn)量及其突變菌株差異蛋白組學(xué)分析.pdf

1、芽孢桿菌產(chǎn)生許多由多功能復(fù)合酶系非核糖體合成的生物活性脂肽。其中以表面活性素(surfactin)在基因水平上研究的較為深入。Surfactin是由SrfA-C三個(gè)NRPSs合成，硫酯酶/?；D(zhuǎn)移酶SrfD刺激該過程的起始。Surfactin是一個(gè)非常強(qiáng)大的生物表面活性劑，可以有效降低水的表面張力。其在生物膜上具有類似生物洗滌劑的作用，并具有特殊的乳化、發(fā)泡、抗病毒和抗支原體活性。其在植物病害的生物防治和生物醫(yī)學(xué)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。此

2、外，脂肽可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)，同時(shí)可以用于提高原油采收率和生物除污。但是，通常的芽孢桿菌菌株脂肽產(chǎn)量很低，迄今為止，抗菌脂肽產(chǎn)生菌的產(chǎn)量一般低于1.0 g/L，少的甚至在0.1 g/L以下，因此提高抗菌脂肽產(chǎn)量顯得尤為重要。目前已經(jīng)有許多學(xué)者嘗試采用不同的方法來增加抗菌肽的產(chǎn)量，但幾乎所有的人都集中在菌株傳統(tǒng)誘變、發(fā)酵優(yōu)化、分離提純或利用基因工程方法調(diào)節(jié)脂肽的合成等方面。
　　 本實(shí)驗(yàn)室孫立軍從藥用植物黃芩中分離出一株

3、抗菌脂肽產(chǎn)生菌——淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amylo lique faciens) ES-2，其對(duì)植物性病原菌、食源性病原菌和腐敗菌以及真菌都有較強(qiáng)的抑制作用。方傳記通過低能N+注入技術(shù)對(duì)該菌進(jìn)行誘變，獲得抗菌脂肽產(chǎn)量提高15.2％的高產(chǎn)突變菌株ES-2-4。在本研究中，以此作為出發(fā)菌株進(jìn)行全基因組重組方法來迅速改善抗菌脂肽產(chǎn)量。同時(shí)利用RT-PCR和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來分析出發(fā)菌株和改組高產(chǎn)菌株之間的差異，具體的研究描述如下

4、:
　　 1.通過紫外線、亞硝基胍及低能N+離子注入誘變建立具有遺傳多樣性的親本庫.以實(shí)驗(yàn)室篩選的抗菌脂肽高產(chǎn)菌株淀粉液化芽孢桿菌ES-2-4為出發(fā)菌株，分別采用紫外線照射(UV)，亞硝基胍(NTG)，或低能N+離子注入誘變，然后稀釋涂布于PDA平板上。通過致死曲線的測(cè)定，確定UV誘變的條件為:紫外線功率20 W，垂直距離15 cm，照射時(shí)間120 s;NTG誘變的條件為:NTG濃度0.4 mg/mL，37℃保溫30 min;N

5、+離子束誘變條件為:注入能量10 kev，時(shí)間10s。 Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4分別采用以上三種方法進(jìn)行誘變，經(jīng)瓊脂柱初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩后獲得六株脂肽產(chǎn)量從40.5-45.8mg/L有所改善的突變株UV89、UV101、N114、N32、Ni49、Ni5。它們經(jīng)10代搖瓶傳代實(shí)驗(yàn)證明，其產(chǎn)surfactin性能穩(wěn)定。以此作為基因組改組的親本菌株，進(jìn)行遞推式原生質(zhì)體融合。
　　 2.對(duì)Ba

6、cillus amyloliquefaciensES-2-4的原生質(zhì)體制備、再生、滅活及融合條件進(jìn)行研究.對(duì)淀粉液化芽孢桿菌原生質(zhì)體制備及再生條件進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明原生質(zhì)制備的最佳條件為:菌體培養(yǎng)時(shí)間為4h，采用0.2 mg/mL溶菌酶酶解液，在37℃的條件下，酶解處理15 min。采用PDA為基礎(chǔ)再生培養(yǎng)基，0.6 mol/L的NaCl做為高滲穩(wěn)定劑，能夠使原生質(zhì)體的再生率達(dá)到24.7％。采用親本原生質(zhì)體滅活的方法檢出融合子，并

7、分別對(duì)紫外線滅活和熱滅活的條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明原生質(zhì)體紫外滅活和熱滅活的最佳條件分別為:20W，15 cm，60 min與100℃，30 min。滅活后的原生質(zhì)體在pH9.0，37℃條件下，用40％ PEG6000融合12 min，融合率為1.04×10-5。
　　 3.利用基因組改婦技術(shù)選育surfactin高產(chǎn)菌株.以紫外線照射、亞硝基胍、和離子束誘變產(chǎn)生的六株高產(chǎn)突變株UV89、UV101、N114、N32、Ni4

8、9及Ni5進(jìn)行遞歸原生質(zhì)體融合。通過致死的紫外線照射滅活和熱處理滅活來創(chuàng)建原生質(zhì)體融合株庫。經(jīng)過兩輪基因組改組，獲得遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)突變株F2-38，其在1L搖瓶和19L發(fā)酵罐中surfactin產(chǎn)量分別是出發(fā)菌株的3.5和10.3倍。
　　 4.利用熒光定量PCR檢測(cè)突變菌株中surfactin合成酶基因表達(dá)量.選取surfactin合成酶基因srfA作為靶基因，16S rDNA作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt相對(duì)定量法檢測(cè)出

9、發(fā)菌株Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4及脂肽高產(chǎn)菌FMB38(F2-38)中srfA基因在轉(zhuǎn)錄階段的表達(dá)差異。2-ΔΔCT相對(duì)定量分析表明，表面活性素合成酶基因（srfA）在FMB38中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量是ES-2-4的15.7倍，與抗菌脂肽產(chǎn)量的增加相一致。
　　 5.建立本實(shí)驗(yàn)室雙向電泳體系。對(duì)2-DE方法進(jìn)行改進(jìn)，分別對(duì)淀粉液化芽孢桿菌蛋白質(zhì)樣品的制備、上樣量、染色方法、膠條pH以及2-DE

10、參數(shù)的選擇等關(guān)鍵步驟進(jìn)行優(yōu)化。其優(yōu)化后條件如下:染色方法選擇銀染;膠條pH值為4-7;24cm膠條上樣量為200μg。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用含7M尿素和2M硫脲的水化液，結(jié)合低電壓脫鹽的等電聚焦可以獲得高分辨率、重復(fù)性好的蛋白質(zhì)2-DE圖譜。銀染后經(jīng)軟件分析，在單張2-DE圖譜上可以檢測(cè)1000以上蛋白點(diǎn)。為本實(shí)驗(yàn)室雙向電泳實(shí)驗(yàn)的開展奠定了基礎(chǔ)。
　　 6.利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析出發(fā)菌株與突變菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)差異.以上述實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)

11、，研究了基因組改組高產(chǎn)菌株FMB38的可溶性全蛋白2-DE圖譜的變化，并對(duì)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。2-DE圖譜分析結(jié)果表明:在FMB38中，凝膠銀染后經(jīng)軟件匹配，對(duì)其中豐度變化在2倍以上的51個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，有46個(gè)蛋白點(diǎn)得到有效地鑒定。其中有3種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白與脂肽合成相關(guān)。其中ComA和DegU豐度變化與其它研究報(bào)道一致，CodY豐度變化與先前的研究相悖。對(duì)所鑒定的蛋白質(zhì)通過COG直系同源簇網(wǎng)站以及