基因組改組選育米曲霉α-淀粉酶高產(chǎn)菌株.pdf

1、基因組改組技術(shù)是建立在原生質(zhì)體融合技術(shù)基礎(chǔ)之上的一種菌種選育技術(shù)。它通過多個親株的融合，使其全基因組進行隨機重組，獲得第一代融合株；再從中選擇獲得進一步提高的菌株作為下一輪融合的直接親本，依此類推進行多輪的多親株融合，最終從獲得的突變體庫中篩選出性狀提升的目的菌株。利用基因組改組技術(shù)可以在較短時間內(nèi)獲得性狀優(yōu)良的重組體，同時剔除負突變，這在很大程度上彌補了傳統(tǒng)誘變法的不足。 淀粉酶做為工業(yè)生產(chǎn)中最為重要的酶之一，有各種不同的用途

2、。目前α-淀粉酶已經(jīng)廣泛用于食品、發(fā)酵、谷物加工、紡織、造紙、醫(yī)藥等各個方面。在淀粉酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)上，主要以微生物發(fā)酵生產(chǎn)為主，也可從植物和動物中提取。 本研究從土樣中篩選真菌α-淀粉酶，通過液體發(fā)酵選出高產(chǎn)菌株FS528做為出發(fā)菌株，通過形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，將分離得到的菌株命名為Aspe，gillus or，zae FS528，再利用基因組改組選育米曲霉高產(chǎn)α-淀粉酶的菌株。 一、真菌α-淀粉酶產(chǎn)生菌篩選與鑒

3、定 從土壤中篩選獲得一株高產(chǎn)α-淀粉酶真菌菌株FS528，產(chǎn)酶水平為2017.3U/mL。對該菌株進行形態(tài)學(xué)初步鑒定，為典型的曲霉屬菌種。提取FS528的18S rDNA，進行測序，并將測序結(jié)果與曲霉屬已知菌種18S rDNA序列進行比對，構(gòu)建進化樹，最終確定該菌株為米曲霉(Aspe，gillus oryzae)。 二、米曲霉原生質(zhì)體制備與再生 對米曲霉原生質(zhì)體制備與再生條件進行了研究。實驗結(jié)果表明原生質(zhì)制備的最

4、佳條件為：菌絲培養(yǎng)時間為14h，采用1％溶菌酶+0.5％蝸牛酶+1％纖維素酶的復(fù)合酶解液，選用0.6mol/L的NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑，在pH 5.0(磷酸鹽緩沖液)，30℃的條件下，酶解處理2.5h。采用PDA為基礎(chǔ)再生培養(yǎng)基，0.6mol/L的NaCl做為高滲穩(wěn)定劑，能夠使原生質(zhì)體的再生率達到30％。 三、基因組改組選育米曲霉高產(chǎn)α-淀粉酶菌株 選用出發(fā)菌株Aspergillus oryzae FS528，F(xiàn)S179

5、，利用基因組改組技術(shù)選育米曲霉α-淀粉酶高產(chǎn)菌株。分別制備FS528，F(xiàn)S179原生質(zhì)體，利用雙親滅活標(biāo)記法，原生質(zhì)體融合條件為：pH6.0、PEG30％、Ca2+0. 02mol/L、融合處理20min。采用透明圈法，從第一輪改組獲得的300個融合子中初篩獲得20個菌株，經(jīng)過液體發(fā)酵復(fù)篩，選出產(chǎn)酶水平最高的兩株菌F1-3，F(xiàn)1-5進行第二輪基因組改組，從300個融合子中進行了初篩與復(fù)篩，獲得產(chǎn)菌水平最高的4個菌株F2-10，F(xiàn)2-14

6、，F(xiàn)2-15，F(xiàn)2-16。其中F2-14產(chǎn)酶水平達到4233.4U/mL，比出發(fā)菌株提高了52.34％。連續(xù)幾代培養(yǎng)與發(fā)酵結(jié)果表明該菌株具備較好的遺傳穩(wěn)定性。 四、改組前后菌株形態(tài)學(xué)觀察與RAPD分子鑒定 通過形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)改組后菌株在生長速度，產(chǎn)孢數(shù)量上與出發(fā)菌株相比，有了較大的改善；通過RAPD擴增檢測，親緣關(guān)系聚類分析結(jié)果表明：原始菌株與第一輪改組得到的兩個菌株親緣關(guān)系最近，與第二輪改組菌株的親緣關(guān)系較遠，而第二