沙門(mén)氏苗富集及ELISA檢測(cè)方法的研究.pdf

1、沙門(mén)氏菌是自然界中普遍存在的一種食源性致病菌,在世界各地的食物中毒事件中沙門(mén)氏菌引起的病例占第一位,沙門(mén)氏菌常引起人類(lèi)急性腹瀉、嘔吐、腹部疼痛、高燒和敗血癥等疾病。沙門(mén)氏菌是革蘭氏陰性腸道桿菌,無(wú)芽孢,周生鞭毛,需氧或兼性厭氧,最適生長(zhǎng)溫度為37℃,具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu),一般可分為菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面(Vi)抗原3種。沙門(mén)氏菌危害巨大,嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此建立一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意

2、義。本研究旨在建立一種快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)的沙門(mén)氏菌免疫磁珠富集方法和雙抗夾心ELISA快速檢測(cè)方法。
　　 以福爾馬林滅活的鼠傷寒沙門(mén)氏菌和五株混合全菌抗原免疫雌性日本大耳兔,制備抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體。分別采用辛酸.硫酸銨沉淀法和磁珠偶聯(lián)抗原吸附法純化抗體,所制備的抗體效價(jià)為3.2×105,純度較高。采用斑點(diǎn)雜交方法檢測(cè)抗體特異性,結(jié)果顯示抗體交叉反應(yīng)現(xiàn)象較嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)以雜菌抗原反向吸附法純化抗體,有效消除了抗體與雜菌的交叉反應(yīng)

3、,初步建立了一種高特異性多克隆抗體的純化方法。
　　 采用EDC和NHSS方法將磁珠與純化后的多克隆抗體偶聯(lián),優(yōu)化偶聯(lián)條件和免疫磁珠捕獲工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:每毫克磁珠最佳偶聯(lián)抗體量為50微克,每次捕獲105CFU/mL沙門(mén)氏菌使用免疫磁珠量為0.3mg,免疫磁珠捕獲目的菌最佳孵育時(shí)間是45min,最佳磁分離時(shí)間是3min,受雜菌干擾小。在雞蛋清、蛋黃、牛奶基質(zhì)和純培養(yǎng)中捕獲效率分別為44.3％、43.2%、65.2%和72.5%

4、?？够旌先嗫寺】贵w制備的免疫磁珠捕獲鼠傷寒沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、鴨沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌,捕獲效率分別為61.4%、45.8%、48.2%、78.5%和64.1%。制備所得抗沙門(mén)氏菌免疫磁珠捕獲效率較高,特異性較好。
　　 本研究以抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體作為捕獲抗體,以C1360單克隆抗體作為檢測(cè)抗體,建立快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌雙抗夾心ELISA方法。結(jié)果表明:該方法對(duì)沙門(mén)氏菌純培養(yǎng)液的最低檢測(cè)量為1.7×1