與衰老相關(guān)異染色蛋白HP1γ相結(jié)合的長(zhǎng)鏈非編碼RNA的初步篩選與鑒定.pdf

1、目的: 來(lái)自基因組的所有轉(zhuǎn)錄物(transcript)一般可以分為兩類:即編碼蛋白質(zhì)的mRNA和非編碼RNA(nocoding RNA，nc RNA)。其中，人類基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中大約有97％-98％是不編碼蛋白質(zhì)的RNA。根據(jù)非編碼RNA的大小可以將它們大致分為:即小于200nt的稱為小nc RNA(small ncRNAs)，長(zhǎng)于200nt的稱之為長(zhǎng)nc RNA(Long nocoding RNAs，Lnc RNAs)。長(zhǎng)期以來(lái)，基因

2、組中大部分非編碼部分通常是被認(rèn)為沒有生物學(xué)功能的。然而新近研究發(fā)現(xiàn)，這些非編碼序列具有與編碼蛋白質(zhì)的基因同樣重要的生物學(xué)功能。
　　非編碼RNA(ncRNA)在細(xì)胞中參與轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞內(nèi)各種生物化學(xué)反應(yīng)催化的多種生物功能。一些ncRNA可以影響蛋白質(zhì)的活性。這是因?yàn)镽NA分子可以通過(guò)結(jié)合蛋白質(zhì)，從而影響相應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、酶活性及該蛋白質(zhì)的配體結(jié)合活性。已有許多資料表明ncRNA可以通過(guò)與蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)控基因的表達(dá)。ncRNA是高

3、等生物遺傳控制機(jī)制的核心物質(zhì)，構(gòu)成與體內(nèi)基因調(diào)控和基因間通訊等功能密切相關(guān)的高級(jí)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，進(jìn)而可以通過(guò)RNA-DNA/染色質(zhì)、RNA-RNA和RNA-蛋白質(zhì)相互作用等方式，在促進(jìn)真核細(xì)胞分化和發(fā)育過(guò)程中控制基因表達(dá)活性復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的整合。
　　細(xì)胞衰老(Cell Senescence，cellular aging)是指在體外培養(yǎng)正常細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞所表現(xiàn)的有限生長(zhǎng)特性，經(jīng)一定的細(xì)胞倍增次數(shù)后，失去對(duì)促分裂因子刺激的反應(yīng)，不可逆的失去增殖能

4、力而停止分裂的過(guò)程。目前研究認(rèn)為，成纖維細(xì)胞的體外增值能力、DNA的損傷修復(fù)能力、端粒的長(zhǎng)度、DNA的甲基化水平、線粒體DNA的片段缺失、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的活性以及晚期糖基化終產(chǎn)物的水平，均能夠作為評(píng)判細(xì)胞衰老的生物學(xué)指標(biāo)。細(xì)胞衰老與腫瘤的形成是相互對(duì)立的，由于細(xì)胞永生化是腫瘤發(fā)生的重要前提，而細(xì)胞永生化及產(chǎn)生癌變的必要條件則是細(xì)胞發(fā)生衰老障礙。細(xì)胞不僅可以通過(guò)凋亡抑制腫瘤形成，還能夠利用衰老阻止細(xì)胞分裂，從而進(jìn)一步抑制腫瘤的發(fā)生

5、。因而，研究細(xì)胞衰老能夠?yàn)槿祟惸[瘤的研究與相關(guān)疾病的治療提供新的方法和手段，對(duì)于人類認(rèn)識(shí)生命的本質(zhì)具有重要的積極意義。
　　但是，目前關(guān)于lncRNA與細(xì)胞衰老的關(guān)系方面研究的很少，研究比較清楚的與細(xì)胞衰老相關(guān)的lncRNA只有l(wèi)ncRNA ANRIL(antisense noncoding RNA in theINK4 locus)。這一結(jié)果提示非編碼RNA在細(xì)胞衰老的過(guò)程中可能起到一些關(guān)鍵的作用。
　　方法: 本研究利用

6、生物信息學(xué)的方法，根據(jù)lnc RNA自身所具有的一種在二級(jí)結(jié)構(gòu)約束下的序列信號(hào)，結(jié)合衰老相關(guān)蛋白的二級(jí)、三級(jí)的空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過(guò)長(zhǎng)非編碼RNA疾病數(shù)據(jù)庫(kù)(LncRNADisease)，對(duì)與8種衰老相關(guān)蛋白(包括HP1γ，p16INK4a，p53，PML，p21，Rb.FOXO3a，Sirt1)相結(jié)合的lnc RNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。選用人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞2BS，通過(guò)運(yùn)用Ras誘導(dǎo)、H2O2化學(xué)法誘導(dǎo)以及復(fù)制性細(xì)胞衰老等三種方法，構(gòu)建了細(xì)胞衰

7、老模型作為實(shí)驗(yàn)篩選的模型。隨后，應(yīng)用oligo6軟件設(shè)計(jì)引物，以Ras及Rasc處理的衰老細(xì)胞和年輕細(xì)胞分別做為模型，對(duì)與衰老相關(guān)蛋白HP1γ可能相結(jié)合的lnc RNA進(jìn)行了引物的純化以及相關(guān)lnc RNA的初步篩選;利用real-time PCR分析初步篩選得到的lnc RNA在Ras誘導(dǎo)、H2O2化學(xué)法誘導(dǎo)以及復(fù)制性衰老三種細(xì)胞衰老模型細(xì)胞中的表達(dá)水平;利用RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation RIP)方

8、法，驗(yàn)證所篩選出來(lái)的lnc RNA能否與HP1γ發(fā)生特異性的結(jié)合。
　　結(jié)果: 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)68種與8種衰老相關(guān)蛋白(包括HP1γ，p16INK4a，p53，PML，p21，Rb.FOXO3a，Sirt1)相結(jié)合的lnc RNA。real-time PCR分析結(jié)果表明，在Ras誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞中與未衰老的細(xì)胞中，8種與HP1γ相關(guān)的lnc RNA的表達(dá)存在較明顯差異。其中，TCONS_12_00008484、TCONS_12_

9、00008486、TCONS_12_00009414、TCONS_12_00009418以及TCONS_12_00009419等5種與HP1γ相關(guān)的lnc RNA，與年輕的細(xì)胞相比，在Ras誘導(dǎo)、H2O2化學(xué)法誘導(dǎo)以及復(fù)制性衰老三種細(xì)胞衰老模型細(xì)胞中的表達(dá)水平升高。RIP分析證明，上述篩選得到的與HP1γ相關(guān)的5種lnc RNA，其中TCONS_12_00008486，TCONS_12_00009418和TCONS_12_0000941