豬長(zhǎng)非編碼RNA-TncRNA的分離、特征鑒定及功能的初步分析.pdf

1、非編碼RNA是一類不編碼蛋白質(zhì)而直接行使結(jié)構(gòu)、催化和調(diào)節(jié)功能的RNA分子,它廣泛存在于生物體的基因組中。長(zhǎng)非編碼RNA是眾多非編碼RNA中的一種,具有類似mRNA的結(jié)構(gòu),至少占生物體10％的poly(A)+RNAs。近來(lái)研究表明,這類非編碼參與眾多的生物學(xué)過(guò)程,如表達(dá)調(diào)控、基因組印記以及應(yīng)激反應(yīng)等。
　　 TncRNA是從本室LongSAGE文庫(kù)中分離得到的一種長(zhǎng)非編碼RNA,它在豬胎兒骨骼肌發(fā)育過(guò)程中是上調(diào)表達(dá)的,且在通城和長(zhǎng)

2、白豬妊娠第90天胎兒骨骼肌差異表達(dá)。其他物種上的研究表明該非編碼RNA在多種病毒感染以及發(fā)育相關(guān)表達(dá)性文庫(kù)中差異表達(dá),但其基本的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能還不清楚。本研究一方面從比較基因組學(xué)的角度出發(fā),探求其基本的分子結(jié)構(gòu)、受調(diào)控機(jī)制以及可能的生物學(xué)功能,另一方面,從候選基因的角度,通過(guò)染色體定位、SNP檢測(cè)和群體分型以及初步的性狀關(guān)聯(lián)分析,為豬的功能基因組領(lǐng)域積累新的基礎(chǔ)資料,為豬的分子標(biāo)記輔助選擇提供新的思路。主要的研究結(jié)果如下:

3、　　 1.從本室構(gòu)建的豬出生前骨骼肌LongSAGE文庫(kù)中分離到一個(gè)非編碼RNA,并用豬輻射雜種板將其定位于豬2p14-17,與SW256標(biāo)記連鎖,序列同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)于人類11號(hào)染色體上的一個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)源的非編碼RNA-TncRNA。克隆了豬TncRNA的全長(zhǎng)cDNA和基因組序列,并分析了它的基因組結(jié)構(gòu)和選擇性剪接情況。
　　 2.生物信息學(xué)結(jié)果表明TncRNA僅存在于真哺乳亞綱動(dòng)物中,多序列比對(duì)結(jié)構(gòu)顯示在真哺乳亞

4、綱動(dòng)物中,序列的歧化非常大,但他們之間都存在一個(gè)200bp的高保守區(qū)域。RNA序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能性位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該非編碼RNA具有異常復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu),且存在多個(gè)Sm蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。
　　 3.時(shí)期表達(dá)譜顯示TncRNA在中外豬品種胎兒骨骼肌中是上調(diào)表達(dá)的,并且在品種間差異表達(dá)。組織表達(dá)譜結(jié)果表明該非編碼RNA在成年母豬大部分組織中都表達(dá)。
　　 4.克隆了人類TncRNA的啟動(dòng)子區(qū)域,并利用生物信息學(xué)獲取了多個(gè)物種的上游

5、調(diào)控區(qū)。利用缺失片段構(gòu)建的報(bào)道子表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人類A549細(xì)胞和A204細(xì)胞,獲取了一個(gè)長(zhǎng)150 nt的核心啟動(dòng)子區(qū)域,并且還發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子區(qū)域具有反向啟動(dòng)的活性；多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該核心區(qū)在物種間是保守的。反式作用因子的預(yù)測(cè)表明該核心調(diào)控區(qū)存在Sp1、CREB、HSF2/1等的結(jié)合位點(diǎn),且這些結(jié)合位點(diǎn)中,大部分在物種間是完全一致的。抑制Sp1的結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性下降72±7％(p<0.01)。
　　 5.在豬TncRNA物種間高度保守的

6、區(qū)域檢測(cè)到3個(gè)SNP位點(diǎn),其中兩個(gè)完全連鎖,應(yīng)用PCR-RFLP方法檢測(cè)了完全連鎖位點(diǎn)的多態(tài)性,并分析了不同豬品種(包括五個(gè)中國(guó)地方豬品種和兩個(gè)西方豬品種)的基因型及基因頻率。
　　 6.在我室與通城縣畜牧局合作組建的試驗(yàn)群體中,對(duì)上述用PCR-RFLP方法檢測(cè)的SNP與部分生產(chǎn)性狀和免疫性狀進(jìn)行初步的關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的肌肉嫩度、pH1值和血紅蛋白濃度差異顯著(P<0.05),
　　 7.成功改造