賈第蟲小分子非編碼RNA的分離、鑒定及功能研究.pdf

1、在細(xì)胞中，除mRNA外，還存在著大量的非編碼RNA(ncRNA)。那些長度介于20～500nt的ncRNA又被稱為小分子非編碼RNA(snmRNA)，它們可能以結(jié)構(gòu)或調(diào)控分子的形式在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。在多種模式生物中大規(guī)模的篩選和鑒定snmRNA，對于研究其分子種類、結(jié)構(gòu)與功能以及基因進(jìn)化規(guī)律具有重要意義。賈第蟲是一種有鞭毛的原生生物，在分類地位上介于原核和真核生物之間，因此成為重要的單細(xì)胞真核模式生物。系統(tǒng)研究其sn

2、mRNA，不僅對于深入了解賈第蟲細(xì)胞RNA的信息具有重要意義，還有可能為研究某些snmRNA的基因進(jìn)化規(guī)律提供重要線索。 本研究采用實(shí)驗(yàn)RNA組學(xué)與計(jì)算機(jī)RNA組學(xué)相結(jié)合的方法，首次對賈第蟲的box H／ACA snoRNA進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并在賈第蟲中篩選到8種box H／ACAsnoRNA候選分子。Northem雜交、RT-PCR和BLAST分析結(jié)果表明這些候選基因中，有7種是首次鑒定的賈第蟲box H／ACA snoRNA

3、。這些snoRNA中絕大部分的分子長度介于100～130m之間，3’末端都含有保守的“ACA”元件。值得注意的是，絕大多數(shù)分子中央部位的“H”元件并不保守，以“ANANNN”的形式存在(“N”替代任何一種核苷酸)。新鑒定的這些snoRNA都可以形成典型的“雙莖環(huán)”二級(jí)結(jié)構(gòu)。雖然本文針對“單莖環(huán)”box H／ACA snoRNA的典型特征也構(gòu)建了相應(yīng)的特異性eDNA文庫，但并沒有篩選到相應(yīng)的候選基因。因此在賈第蟲中，該類snoRNA極有可

4、能只存在“雙莖環(huán)”這一種二級(jí)結(jié)構(gòu)形式。功能分析結(jié)果表明，新鑒定的GLsRl8、GLsRl9、GLsR21、GLsR24和GLsR25分別指導(dǎo)賈第蟲23S rRNA上U2345、U1801、U45、U1753和U2396的假尿嘧啶化修飾。而GLsR22和GLsR23在賈第蟲中沒有找到相應(yīng)的靶分子，屬于功能未知的“orphan”snoRNA，表明賈第蟲box H／ACA snoRNA也具有功能的多樣性。基因組定位分析結(jié)果表明，新鑒定的box

5、 H／ACA snoRNA均由單拷貝基因編碼并位于不編碼蛋白質(zhì)的基因間隔區(qū)中，而且遵循一個(gè)間隔區(qū)只含有一個(gè)snoRNA的原則。但是，GLsR18與此前發(fā)現(xiàn)的box C／D snoRNAGLsR17位于同一間隔區(qū)中并具有相同的轉(zhuǎn)錄方向，northem分析表明它們是由同一轉(zhuǎn)錄前體加工成熟的，這是在賈第蟲中首次發(fā)現(xiàn)的snoRNA雜合基因簇。 在本研究中，還同時(shí)構(gòu)建了tiny RNA的非特異性cDNA文庫，對賈第蟲的tiny non-

6、coding RNA(tncRNA)進(jìn)行了篩選和分類，并對內(nèi)源性siRNA介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)座子基因沉默機(jī)制進(jìn)行了初步研究。對賈第蟲15～30nt長的tiny RNA非特異性cDNA文庫進(jìn)行測序和篩選，共獲得44個(gè)tncRNA分子，其中tncRl～tncR11全部都是反義小分子RNA，根據(jù)靶基因的不同可將其分為兩類。第一類是反轉(zhuǎn)座子相關(guān)的tncRNA(tncRl～tncR3)，它們分別與賈第蟲GilM和GilT反轉(zhuǎn)座子的3’-UTR互補(bǔ)。這些t

7、ncRNA與線蟲中發(fā)現(xiàn)的Tcl siRNA非常相似，提示在賈第蟲中很可能還存在著更多類似的tncRNA。與此不同，另外一類是mRNA相關(guān)的tncRNA(tncR4～tncR11)，它們與預(yù)測的靶mRNA基因都有15～22nt的互補(bǔ)配對，而且靶位點(diǎn)絕大部分都位于mRNA的開放讀碼框中央?yún)^(qū)域。這些tncRNA與在植物和線蟲中發(fā)現(xiàn)的僅與mRNA降解有關(guān)的內(nèi)源性反義小分子RNA非常相似，很可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控賈第蟲中相關(guān)mRNA的基因沉默。利用

8、northern雜交分析，發(fā)現(xiàn)在賈第蟲中存在著18～23nt和28～30nt兩種不同長度的反轉(zhuǎn)座子相關(guān)的tncRNA。這些tncRNA表達(dá)豐度很低，并且都只與反轉(zhuǎn)座子GilM和GilT的3’-UTR有關(guān)，而與蛋白質(zhì)編碼區(qū)無關(guān)。DNA甲基化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GiIM和GilT反轉(zhuǎn)座子的大部分DNA序列(包括全部蛋白質(zhì)編碼區(qū)和3’-UTR 5’端部分區(qū)域)都被高度甲基化，而3’-UTR的3’端則沒有被甲基化。分析線蟲、植物和四膜蟲中己發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性s

9、iRNA的特征，在賈第蟲中檢測到的這些tncRNA很可能就是內(nèi)源性的反轉(zhuǎn)座子siRNA，并在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩個(gè)水平同時(shí)調(diào)控GilM和GilT反轉(zhuǎn)座子的基因沉默，以維持基因組的穩(wěn)定性。 在本研究中，還意外的發(fā)現(xiàn)了大量長度集中在17～21nt、來源于多種不同的成熟tRNA的tiny RNA。這些分子中的絕大部分來源于成熟tRNA的3’末端部位，而且其豐度要遠(yuǎn)高于來源于其它部位的tiny RNA。分析發(fā)現(xiàn)，在多種不同的成熟tRNA分子

10、中存在多個(gè)相似的切割位點(diǎn)，并且主要位于TψC-100p和TψC-stem中保守甲基化修飾位點(diǎn)附近。用由17種成熟tRNA特異性的DNA混合探針進(jìn)行northem分析，發(fā)現(xiàn)這些tRNA-derived tiny RNA在細(xì)胞中穩(wěn)定存在。這表明在賈第蟲細(xì)胞正常生長過程中，某些核酸內(nèi)切酶在體內(nèi)特異性的識(shí)別這些位點(diǎn)，并將成熟tRNA進(jìn)一步剪切加工成為大小相對均一的tiny RNA。 對賈第蟲boxH/ACA snoRNA的研究表明，實(shí)

11、驗(yàn)：RNA組學(xué)與計(jì)算機(jī)RNA組學(xué)方法結(jié)合使用能有效發(fā)揮各自的優(yōu)勢，并大大提高鑒定snoRNA的效率。與分類地位臨近的古細(xì)菌、錐蟲、以及眼蟲中已發(fā)現(xiàn)的同類分子相比，賈第蟲boxH/ACA snoRNA具有很多獨(dú)特性，提示snoRNA在從原核生物向真核生物進(jìn)化的過程中可能具有不同的進(jìn)化路線。而對tiny RNA的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，在賈第蟲中存在著大量不同種類的tncRNA，它們在基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。賈第蟲兩類不同長度的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)座子siR