淺灰鏈霉菌70014代謝物質(zhì)除草活性的研究.pdf

1、本文希望利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)具有除草活性的化合物,開發(fā)出具有高效、低毒、環(huán)境相容性好的除草劑品種,以克服傳統(tǒng)化學(xué)合成除草劑所帶來的污染環(huán)境、影響后茬作物生長、雜草抗性等一些負面影響,并填補國內(nèi)無生物發(fā)酵類除草劑的空白。
　　 作者經(jīng)過對從土壤中分離的大量放線菌進行初步篩選后,得到1株編號為70014的菌株,其發(fā)酵液在多次生物活性篩選中體現(xiàn)出較好的除草活性。在對該菌株采用培養(yǎng)特征、生理生化指標(biāo)、細胞壁分析以及16S rDNA基因

2、序列分析等鑒定方法后,確定該菌株為鏈霉菌屬的淺灰鏈霉菌(Streptomyces griseolus)中的一員。該菌株作為專利保護菌種保藏在中國普通微生物培養(yǎng)保藏中心(ChinaGeneral Microbiology Culture Center CGMCC)。
　　 采用溶劑萃取、硅膠層析及制備HPLC等手段對該菌株發(fā)酵產(chǎn)物進行了活性跟蹤分離,得到1個活性化合物。通過對該化合物理化性質(zhì)及波譜學(xué)分析,確定其結(jié)構(gòu)為2-[2-(3

3、,5二甲基-2-氧-環(huán)己基)-6-氧-四氫吡喃-4-基]-乙酰胺。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)該化合物與文獻報道的抗生素A75934結(jié)構(gòu)一致,但該化合物的除草活性為本文首次發(fā)現(xiàn)。
　　 對化合物原藥的毒理學(xué)試驗結(jié)果表明:該化合物對雌雄大鼠的急性經(jīng)口LD50分別為158和135 mg/kg體重,屬于中等毒性化合物；對大鼠的急性經(jīng)皮毒性其LDso均大于5000 mg/kg體重,屬于微毒化合物；眼睛刺激試驗表明該化合物屬于輕度到中度刺激,而對皮膚的刺激

4、表明為輕度刺激；Ames試驗結(jié)果表明該化合物無致突變風(fēng)險。
　　 通過紫外線-氯化鋰誘變、亞硝基胍誘變,氮芥誘變等手段,將70014菌株從原始的不到10 mg/l提高到320 mg/l。還運用了超聲波破壁-UV照射、超聲波破壁.微波處理、吖叮黃處理、等離子體注入誘變等育種技術(shù)獲得突變株A-67和A-95,發(fā)酵單位大幅提高到520 mg/l和580 mg/l,經(jīng)搖瓶和發(fā)酵罐發(fā)酵試驗,證明有穩(wěn)定遺傳的特性。
　　 利用Pla

5、ckett-burman實驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基的組成,使發(fā)酵單位提高到880 mg/l,比優(yōu)化前的560 mg/l提高了54％。在此基礎(chǔ)上,在自動發(fā)酵罐進行了發(fā)酵工藝的研究,通過對其發(fā)酵動力學(xué)的研究,確定了發(fā)酵罐攪拌速度、通氣量等發(fā)酵控制因素,并在250升發(fā)酵罐上進行放大驗證,使平均發(fā)酵單位達到910 mg/l。
　　 通過對各種分析方法的比較,選定了以O(shè)DS C18柱、流動相為甲醇、乙腈和水的高壓液相色譜分析方

6、法,根據(jù)該方法進行的分析其準確度、精密度等都符合分析方法的要求。根據(jù)化合物性質(zhì)和提取工藝路線,同時考慮到農(nóng)藥制劑往水基化方向發(fā)展的趨勢,研發(fā)了水溶性液劑這一制劑。
　　 室內(nèi)外的藥效試驗證明,化合物SPRI-70014具有很強的除草活性。種子萌發(fā)試驗結(jié)果表明,該化合物可以顯著抑制多種作物種子的萌發(fā)和根的生長,在1mg/l濃度時,即可徹底抑制多種試驗作物種子的萌發(fā)。盆栽試驗和除草譜試驗發(fā)現(xiàn)該化合物對大多數(shù)闊葉雜草的活性高于禾本科雜

7、草。作物安全性試驗結(jié)果表明該化合物在推薦劑量時對黃瓜等多種作物產(chǎn)生嚴重藥害癥狀,但是在推薦劑量的倍量時,對花生和小麥依然安全,顯示出其在這兩種作物中的應(yīng)用前景。田間試驗結(jié)果顯示在1000 g.ai/ha時,對大多數(shù)試驗雜草的具有良好的防治效果。
　　 對其作用機制的研究表明SPRI-70014通過抑制谷氨酰胺合成酶(GS)而影響葉片蛋白質(zhì)組成,從而造成植株枯萎死亡。對其作用方式的試驗證明該化合物具有觸殺性除草劑的特性,并兼有一定