一株綠色產(chǎn)色鏈霉菌抗菌活性及代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、本論文以一株綠色產(chǎn)色鏈霉菌為研究對(duì)象，對(duì)綠色產(chǎn)色鏈霉菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了一系列的研究，包括綠色產(chǎn)色鏈霉菌高活性抗菌菌株的選育、生產(chǎn)工藝、代謝產(chǎn)物安全性、代謝產(chǎn)物中抗菌活性成分的分離工藝、代謝產(chǎn)物的動(dòng)物應(yīng)用效果等。在一系列研究工作的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出一種能夠顯著改善動(dòng)物飼喂條件的新型發(fā)酵床。
　　 利用產(chǎn)氣梭狀芽孢桿菌作為指示菌株，以代謝產(chǎn)物的抑菌活性為指標(biāo)，依次利用同步輻射軟X射線、低能離子束誘變、紫外誘變、微波誘變技術(shù)對(duì)綠色產(chǎn)色鏈霉菌

2、的原始菌株進(jìn)行誘變選育，得到一株誘變菌株W26菌株，該菌株遺傳性狀穩(wěn)定、其代謝產(chǎn)物的抗菌能力較高。因此，確定綠色產(chǎn)色鏈霉菌誘變菌株W26菌株為本研究的目標(biāo)菌株。
　　 針對(duì)W26菌株液體發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了W26菌株的搖瓶液體培養(yǎng)基，同時(shí)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了探討。研究結(jié)果表明：W26菌株搖瓶液體最佳培養(yǎng)基配方為：(NH4)2SO42％、蛋白胨2％、甘露醇0.5％、豆粕粉3％、葡萄糖0.5％、NaCl 0.1％、Mg

3、SO4·7H2O0.05％、K2HPO4 0.01％。綠色產(chǎn)色鏈霉菌W26菌株以抑菌活性為指標(biāo)的最佳搖瓶培養(yǎng)條件為：裝液量120ml∕250ml、接種量為15％、種齡3d、轉(zhuǎn)速130r/m，培養(yǎng)時(shí)間為42h，培養(yǎng)溫度為28℃。同時(shí)詳細(xì)研究了在中試發(fā)酵過(guò)程中通氣量和攪拌速度對(duì)W26菌株菌體生長(zhǎng)和抗菌活性物質(zhì)積累的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示以搖瓶發(fā)酵最佳培養(yǎng)基為中試培養(yǎng)基，以10％的接種量進(jìn)行接種，攪拌速度為240r/m、通氣量為1.5V/V·mi

4、n、發(fā)酵培養(yǎng)36h時(shí)菌株代謝產(chǎn)物中抑菌活性成分的累積最多。
　　 對(duì)利用中試發(fā)酵過(guò)程獲得的W26菌株的發(fā)酵菌絲體進(jìn)行了抑菌活性追蹤下的抗菌活性成分的研究。結(jié)果表明，綠色產(chǎn)色鏈霉菌代謝產(chǎn)物中的抑菌活性成分在丙酮中的溶解度較高。利用反復(fù)硅膠柱層析對(duì)丙酮相進(jìn)行進(jìn)一步純化之后，得到一種已知化合物阿維拉霉素A組分和一個(gè)具有較高抗菌活性的組分樣品Ⅹ，對(duì)樣品Ⅹ進(jìn)行后續(xù)反復(fù)硅膠柱層析純化后得到具有抗菌活性的樣品5，利用高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用(L

5、C-MS)等分析方法對(duì)樣品5進(jìn)行研究之后發(fā)現(xiàn)，樣品5的分子式為C79H80O19Cl2，相對(duì)分子量為1402。
　　 對(duì)綠色產(chǎn)色鏈霉菌的發(fā)酵菌絲體進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：根據(jù)小鼠急性經(jīng)口毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，綠色產(chǎn)色鏈霉菌W26菌株代謝產(chǎn)物屬無(wú)毒級(jí)；Ames試驗(yàn)未檢出綠色產(chǎn)色鏈霉菌代謝產(chǎn)物有明顯的誘變活性；小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)也見(jiàn)發(fā)酵代謝產(chǎn)物對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞具有誘發(fā)微核作用；小鼠睪丸初級(jí)精母細(xì)胞染色體畸變分析表明綠色產(chǎn)

6、色鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物對(duì)雄性小鼠睪丸初級(jí)精母細(xì)胞染色體無(wú)誘變活性。以上安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明綠色產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中是安全的。
　　 以青腳土雜肉雞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)綠色產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵代謝物的實(shí)際應(yīng)用效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明肉雞日糧中按照600mg∕kg的添加量添加綠色產(chǎn)色鏈霉菌的液體發(fā)酵菌絲體可以顯著提高肉雞日增重、降低日均耗料量、改善飼料的轉(zhuǎn)化率，提高肉雞的抗病能力和屠宰性能。發(fā)酵菌絲體在動(dòng)物日糧中的添加雖然可以提

7、高肉雞肌肉中灰分、必需氨基酸的含量，但是效果不顯著。在豬的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中，綠色產(chǎn)色鏈霉菌的菌絲體按照600mg∕kg的添加比例添加到日糧中可以顯著提高斷奶仔豬和生長(zhǎng)豬的生長(zhǎng)性能，降低生長(zhǎng)豬的腹瀉率。
　　 為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)綠色產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物在動(dòng)物應(yīng)用中的潛力，本研究在自行分離、制備徐州當(dāng)?shù)赝林⑸锏幕A(chǔ)上添加一定數(shù)量的乳酸菌和芽孢桿菌作為發(fā)酵原種，并在液體發(fā)酵的過(guò)程中經(jīng)抗生素抗性篩選，獲得了高抗性的微生物原種，研制出一種新型發(fā)