長(zhǎng)效人血清白蛋白的制備及其生物功能與藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、人血清白蛋白（humanserumalbumin，HSA）是人血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，濃度可達(dá)42±3.5g/L。HSA提供80％的血漿膠體滲透壓(colloidosmoticpressure，COP)，其臨床藥效主要為血容量擴(kuò)充、維持血漿膠體滲透壓和血液稀釋等。HSA臨床適應(yīng)癥廣泛，包括血容量不足、出血性休克、燒傷、白蛋白減少癥、急性肝損傷、腹水、外科手術(shù)、急性呼吸窘迫綜合征和血液透析等。
　　 近年來，由于血液來源短缺等原

2、因致使HSA供應(yīng)十分緊張，如何解決HSA的來源緊缺問題已成為目前HSA研究的熱點(diǎn)?；诖?，科研工作者主要圍繞以下兩個(gè)方面展開研究，尋找HSA的替代品，一是利用聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)對(duì)非人源白蛋白進(jìn)行修飾以消除其免疫原性，但其安全性讓人擔(dān)憂;二是利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)重組人血清白蛋白（recombinantHSA，rHSA）。目前，HSA已在細(xì)菌、真菌、植物及動(dòng)物中成功表達(dá)，但由于HSA臨床應(yīng)用劑量較大（每

3、次可達(dá)5～10g）和rHSA產(chǎn)率較低等原因，實(shí)現(xiàn)高純度、低成本的藥物級(jí)rHSA的大規(guī)模生產(chǎn)是個(gè)極具挑戰(zhàn)性的課題。
　　 此外，HSA的臨床應(yīng)用也存在一定局限性。如在燒傷、感染或失血等病理情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，毛細(xì)血管通透性增加，血容量下降，及時(shí)有效地進(jìn)行血容量擴(kuò)充非常重要。然而毛細(xì)管滲透性增加可加速HSA的血管外滲，導(dǎo)致HSA血容量擴(kuò)充作用維持時(shí)間較短，引起或加重組織水腫，不利于病情緩解。
　　 針對(duì)以上HSA來源短

4、缺和血管保留率低等問題，本課題設(shè)想:采用PEG對(duì)HSA進(jìn)行共價(jià)修飾，PEG分子具有巨大的水化體積，與HSA偶聯(lián)后將賦予HSA較大的分子半徑，從而減少血管滲漏，增加外源性輸注的HSA的血管保留率，使其充分發(fā)揮血容量擴(kuò)充作用;同時(shí)PEG修飾能顯著改善蛋白質(zhì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，對(duì)HSA進(jìn)行PEG修飾有望延長(zhǎng)其生物半衰期，降低用藥頻率，在藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)方面也具有一定意義。
　　 本課題的主要研究?jī)?nèi)容及取得的成果有以下幾個(gè)方面:
　　

5、 1.HSA的分離純化及PEG定點(diǎn)和隨機(jī)修飾產(chǎn)物的制備
　　 PEG修飾反應(yīng)原料的純度與修飾產(chǎn)物的均一性和反應(yīng)產(chǎn)率密切相關(guān)，為了提高反應(yīng)產(chǎn)率獲得均一性良好的PEG修飾產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)采用SephacrylS-200凝膠柱層析和超濾法對(duì)血漿來源的HSA進(jìn)行分離純化。利用HSA分子上唯一的半胱氨酸殘基，以相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為20kDa的單甲氧基聚乙二醇-馬來酰亞胺(mPEG-MAL)為修飾劑，對(duì)HSA進(jìn)行Cys34定點(diǎn)修飾;利用N-

6、末端氨基酸殘基上的α-氨基和HSA主鏈上賴氨酸上的ε-氨基的pKa值不同，以單甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)為修飾劑，對(duì)HSA進(jìn)行N-末端定點(diǎn)修飾。采用單因素分析和正交試驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件，確定最佳反應(yīng)條件。修飾產(chǎn)物經(jīng)DEAESepharoseFF柱層析和超濾法兩步分離純化，獲得Cys34定點(diǎn)修飾產(chǎn)物(PEG-cys34HSA)和N-末端定點(diǎn)修飾產(chǎn)物(N-terminalPEG-HSA)。同時(shí)采用氰尿酰氯活化的PEG對(duì)HSA進(jìn)行隨

7、機(jī)修飾，制備Mr相當(dāng)?shù)碾S機(jī)修飾產(chǎn)物(randomPEG-HSA)，以作為體內(nèi)外性質(zhì)測(cè)定的對(duì)照品。
　　 結(jié)果顯示，SephacrylS-200凝膠柱層析和超濾法兩步純化可顯著提高HSA純度，HSA的純度由純化前的91％提高到99.8％。mPEG-MAL與HSA的最佳反應(yīng)條件經(jīng)單因素分析確定為:pH6.5、50mmol/L磷酸鹽緩沖液(含10mmol/LEDTA);HSA濃度為5mg/mL;HSA∶PEG摩爾比為1∶2;37℃水浴

8、搖床振搖20h，該最佳反應(yīng)條下修飾產(chǎn)率達(dá)到50％以上。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)粗略估計(jì)修飾產(chǎn)物的Mr約為90kDa，證實(shí)該修飾產(chǎn)物為單修飾產(chǎn)物。mPEG-ALD與HSA的最佳反應(yīng)條件為:pH6.0、10mmol/L磷酸鹽緩沖液;HSA∶PEG摩爾比為1∶3;HSA濃度為5mg/mL;在反應(yīng)結(jié)束前6h加還原劑NaCNBH3;4℃反應(yīng)36h。按照以上優(yōu)化的反應(yīng)條件制備的HSA的N-末端定點(diǎn)修飾產(chǎn)物(N-terminalPEG-HSA)均一性好

9、，SDS-PAGE檢測(cè)單修飾率可達(dá)35％。PEG-cys34HSA和N-terminalPEG-HSA經(jīng)DEAESepharoseFF柱層析和超濾法兩步法純化所得樣品經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純度可達(dá)95％和91％。氰尿酰氯活化的PEG-6000與HSA的修飾產(chǎn)物分子量分布廣泛，采用DEAECellulose柱層析和超濾法獲得平均分子量約為90kDa左右的隨機(jī)修飾產(chǎn)物，與定點(diǎn)修飾產(chǎn)物Mr相當(dāng)，可作為體內(nèi)外性質(zhì)測(cè)定的對(duì)照品。
　　 2

10、.HSA及其PEG修飾產(chǎn)物的性質(zhì)測(cè)定
　　 對(duì)HSA及其PEG修飾產(chǎn)物(PEG-cys34HSA、N-terminalPEG-HSA和randomPEG-HSA)的理化性質(zhì)和修飾參數(shù)進(jìn)行分析鑒定，主要包括修飾產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量、修飾位點(diǎn)和流體力學(xué)半徑等。
　　 結(jié)果顯示:利用圓二色譜法(CD)測(cè)定HSA及其PEG修飾產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況，修飾前后HSA的CD圖譜峰形類似，幾乎完全重合，這說明兩者的二級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎完全一

11、致，提示PEG修飾并未影響HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu);采用動(dòng)態(tài)激光散射法(DLS)測(cè)得HSA、PEG-cys34HSA和N-terminalPEG-HSA的流體力學(xué)半徑(Rh)分別為7.81、47.25和50.74nm，HSA經(jīng)PEG修飾后，Rh增加為原來的6～6.5倍，HSA在水溶液中的流體力學(xué)半徑顯著提高;采用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)封閉法確定PEG-cys34HSA的修飾位點(diǎn)，SDS-PAGE證實(shí)NEM處理的HSA不能發(fā)生PEG化反應(yīng)，

12、以此證實(shí)修飾反應(yīng)發(fā)生在唯一一個(gè)游離半胱氨酸-34位半胱氨酸;采用高效凝膠滲透色譜-多角度激光散射聯(lián)用法(GPC-MALS)測(cè)定N-terminalPEG-HSA的Mr為83.71kDa，確定該修飾產(chǎn)物為單修飾產(chǎn)物。
　　 3.HSA及其PEG修飾產(chǎn)物的藥物結(jié)合性質(zhì)研究
　　 HSA是人血漿中含量最為豐富的一種載體蛋白，研究藥物與HSA及其修飾產(chǎn)物的結(jié)合性質(zhì)，對(duì)于了解藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分布以及代謝過程具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采

13、用表面等離子共振技術(shù)(SPR)研究了兩種模型藥物（華法林和萘普生）與HSA及其PEG修飾產(chǎn)物的相互作用。
　　 結(jié)果顯示，SPR技術(shù)能夠準(zhǔn)確反映HSA及其PEG修飾物與藥物的結(jié)合水平。采用解離平衡常數(shù)（KD）衡量配基（華法林和萘普生）與受體（HSA及其PEG修飾產(chǎn)物）的相互結(jié)合能力，KD值愈小結(jié)合能力愈大。華法林與HSA、PEG-cys34HSA、N-terminalPEG-HSA和randomPEG-HSA相互作用的KD值分別

14、為:12.9、24、14.2和67.6μmol/L，萘普生與HSA、PEG-cys34HSA、N-terminalPEG-HSA和randomPEG-HSA相互作用的KD值分別為24.6、36、27.7和44.7μmol/L。不同修飾位點(diǎn)對(duì)結(jié)合能力影響不盡相同，定點(diǎn)修飾對(duì)HSA與藥物結(jié)合影響作用較小，與Cys34定點(diǎn)修飾相比，N-末端氨基定點(diǎn)修飾對(duì)HSA與藥物的親和力影響較小。而隨機(jī)修飾由于其修飾位點(diǎn)較多且修飾位點(diǎn)不確定，能夠明顯降低H

15、SA與藥物的親和力。
　　 4.人血清白蛋白及其PEG修飾產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布研究
　　 本實(shí)驗(yàn)采用125I放射標(biāo)記法和三氯乙酸(TCA)沉淀法研究HSA及其PEG修飾產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)的血漿半衰期和組織分布等性質(zhì)。結(jié)果顯示，HSA及其PEG修飾產(chǎn)物在小鼠的體內(nèi)過程符合二室模型，HSA、PEG-cys34HSA、N-terminalPEG-HSA和randomPEG-HSA的消除半衰期（t1/2β）分別為9.

16、51±2.22、21.91±2.00、22.50±1.70和22.93±1.51h，PEG修飾后t1/2延長(zhǎng)為未修飾前的2.3～2.4倍左右。同時(shí)可以觀察到，修飾產(chǎn)物的藥時(shí)曲線下面積(AUC)和平均保留時(shí)間(MRT)都較未修飾前增大，血漿清除率(CL)也有所降低，以上結(jié)果均提示PEG修飾能夠改善HSA在體循環(huán)的保留率。各修飾產(chǎn)物與HSA相比，各時(shí)間點(diǎn)的組織分布量相當(dāng)，并未顯示明顯的組織分布特異性。
　　 5.HSA及其PEG修飾

17、產(chǎn)物在急性肺損傷模型中的毛細(xì)血管透過率和對(duì)膿毒癥的藥效學(xué)研究
　　 本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)毒素脂多糖(LPS)吸入給藥誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷(ALI)模型，引起肺部毛細(xì)血管通透性增加，考察HSA及其PEG修飾產(chǎn)物在肺部毛細(xì)血管的滲出;利用LPS尾靜脈注射誘導(dǎo)大鼠膿毒血癥模型，以大鼠的紅細(xì)胞壓積(Hct)和平均動(dòng)脈壓(MAP)為考察指標(biāo)，評(píng)價(jià)PEG-cys34HSA對(duì)大鼠膿毒血癥的治療作用。
　　 肺部毛細(xì)血管的透過率結(jié)果顯示，三種修飾

18、產(chǎn)物給藥組的血管滲出量明顯低于HSA，提示PEG修飾可有效減少HSA向肺實(shí)質(zhì)的滲漏。HSA和定點(diǎn)修飾產(chǎn)物PEG-cys34HSA對(duì)膿毒血癥的藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，LPS給藥后2h，各組的Hct均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，MAP也呈現(xiàn)大幅度下降，降幅大于40mmHg，以上結(jié)果提示造模成功。HSA與PEG-cys34HSA給藥后2h，HSA給藥組的MAP由92±6mmHg上升為98±15mmHg，而PEG-cys34HSA給藥組的MAP由92±12mmH

19、g升至117±7mmHg，上升幅度明顯高于HSA組(P＜0.05)。同時(shí)，各組在給與液體輸注后2h，Hct均有所降低，表現(xiàn)為血液稀釋，血容量升高，其中PEG-cys34HSA血液稀釋作用強(qiáng)于生理鹽水組和HSA組(P＜0.05)，提示PEG-cys34HSA可更有效地?cái)U(kuò)充血容量。
　　 本研究取得的主要成果和結(jié)論:
　　 1.采用mPEG-MAL和mPEG-ALD為修飾劑，與HSA反應(yīng)能夠獲得均一的定點(diǎn)單修飾產(chǎn)物，修飾反應(yīng)

20、條件溫和、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、單修飾率較高。采用DEAESepharoseFF柱層析和超濾法兩步純化可獲得純度較高的修飾產(chǎn)物。
　　 2.PEG修飾對(duì)HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響較小，可顯著增加修飾蛋白的水化半徑。
　　 3.不同修飾位點(diǎn)對(duì)PEG修飾產(chǎn)物與小分子藥物的結(jié)合能力影響不盡相同，定點(diǎn)修飾對(duì)HSA與藥物結(jié)合影響作用較小，而隨機(jī)修飾能夠明顯降低HSA與藥物的親和力。
　　 4.PEG修飾可延長(zhǎng)HSA的消除半衰期，改