直鏈和支鏈PEG定點修飾對人血清白蛋白結(jié)構(gòu)和藥效學的影響以及PEg-人血清白蛋白的藥代動力學研究.pdf

1、研究背景及目的
　　人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是一種調(diào)劑體內(nèi)液體分布的最重要的調(diào)節(jié)劑，維持著血漿內(nèi)80％的膠體滲透壓(colloid osmotic pressure，COP)，也是在血液中運輸許多內(nèi)源性化合物（例如脂肪酸、血紅素、膽紅素等）的重要載體。HSA在臨床上有著非常重要和廣泛的用途，其適應證包含燒傷、白蛋白減少癥、出血性休克、血容量不足、腹水、急性呼吸窘迫綜合征等。但是，目前HSA在臨

2、床上的應用存在著諸多爭議，這主要是由于機體在燒傷、失血等病理條件下血管內(nèi)皮細胞常常會受到損傷，從而造成毛細血管的間隙增加，血管通透性增大。此時，應用HSA進行血容量擴充，輸注到血管內(nèi)的HSA會滲透到組織間隙中，造成組織水腫，進一步加重疾病的病情。另外，由于HSA的臨床應用劑量較大，目前雖然應用基因工程技術(shù)已經(jīng)能夠成功表達生產(chǎn)出重組HSA，但實現(xiàn)高純度、大規(guī)模的生產(chǎn)仍然面臨著很大的挑戰(zhàn)。因此，以血液為主要來源的HSA的供應仍舊十分緊張。<

3、br>　　針對HSA在臨床應用中由于血管通透性增加所導致的滲出增加以及HSA來源較為緊張的問題，本實驗室采用高相對分子質(zhì)量（relative molecular mass,Mr）的PEG對HSA進行定點修飾，設想通過PEG修飾增大HSA的分子半徑來減少HSA在血管內(nèi)的滲漏、延長其半衰期、提高其用藥安全性、降低其用藥頻率。本實驗室在以往的研究中通過動態(tài)光散射和圓二色譜法證實了高MrPEG定點修飾可顯著增加HSA的流體力學半徑且不影響HSA

4、的二級結(jié)構(gòu);通過125I放射標記法對HSA及其PEG修飾產(chǎn)物的藥代動力學研究，證實了PEG-HSA的在體內(nèi)的半衰期顯著延長;通過小鼠急性肺損傷模型和大鼠膿毒血癥模型證實了PEG修飾可有效減少HSA從血管的滲漏，能更有效地發(fā)揮血容量擴充的作用。
　　本論文在本實驗室以往的研究基礎上，通過研究20 kDa直鏈和支鏈PEG定點修飾的HSA在大鼠失血性休克模型中作為血容量擴充劑的療效，考察PEG修飾對HSA作為血容量擴充劑的影響和其相關(guān)機

5、制，并考察支鏈PEG修飾的HSA是否具有藥效學的優(yōu)勢;利用小角散射技術(shù)研究不同Mr和不同構(gòu)型的PEG在HSA表面的空間取向和對蛋白結(jié)構(gòu)的影響，并采用表面等離子共振技術(shù)(surfaceplasmon resonance，SPR)研究其對于臨近Cys34的血紅素結(jié)合位點結(jié)合能力的影響;通過采用Nano液相-串聯(lián)質(zhì)譜（nanoliquid chromatography tandem masschromatography，NanoLC-MS/M

6、S）檢測PEG-HSA經(jīng)酶解后的肽段來對完整的PEG-HSA進行定量，建立了一種新的高靈敏度、高選擇性地對大鼠血漿中的PEG-HSA進行定量的方法，以解決放射性同位素不穩(wěn)定、易脫落的問題，為更準確地反映藥物真實的藥代動力學情況提供新的方法。
　　本論文的主要研究內(nèi)容、研究方法和研究結(jié)果
　　1PEG定點修飾的HSA用于失血性休克血液復蘇的研究
　　方法:本論文采用大鼠的失血性休克模型，以生理鹽水、8％HSA和25％HS

7、A作為對照，考察了直鏈和支鏈的20 kDaPEG定點修飾的HSA作為血容量擴充劑的血液復蘇療效和對再灌注損傷的影響。利用大鼠的平均動脈壓和血氣參數(shù)來反映大鼠在失血性休克和血液復蘇治療中的整體狀態(tài);利用血液流變學參數(shù)來評價不同的血容量擴充劑對大鼠血液中紅細胞性質(zhì)和血液黏度的影響。血液及組織中內(nèi)皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemota

8、ctic protein-1，MCP-1)的含量分別與血管壁的剪切應力和血管的收縮擴張有關(guān)，因此本論文利用MCP-1和eNOS來評價血液復蘇后微血管的狀態(tài)。另外，本論文通過對炎癥相關(guān)因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2進行了檢測，同時結(jié)合對大鼠肺部組織進行的蘇木素/伊紅(haematoxylin

9、and eosin，HE)染色，全面研究實驗中大鼠肺部組織的再灌注損傷情況，綜合評價PEG修飾的HSA用于失血性休克血液復蘇的防護作用及機制。
　　結(jié)果:在血液復蘇90 min時，直鏈和支鏈20 kDaPEG定點修飾的HSA（L-PEG-HSA和Y-PEG-HSA）組大鼠的平均動脈壓分別為（91.00±2.10）mmHg、（91.83±1.17）mmHg，要顯著高于生理鹽水組（（67.29±4.46）mmHg）、8％HSA(HSA

10、8)組（（73.17±5.95)mmHg）、25％HSA(HSA25)組（（83.00±2.53)mmHg）。兩組PEG-HSAs實驗組的PaO2、pH、Hb、BE等血氣指標與休克結(jié)束時相比也有顯著性地改善。這表明，與HSA相比，PEG-HSAs能在相對更長的時間內(nèi)發(fā)揮更有效的血容量擴充作用，能更有效地提高大鼠的平均動脈壓、血氣參數(shù)。另外，PEG-HSAs能促進大鼠體內(nèi)的MCP-1和eNOS的表達，顯著提高全血低切還原黏度和血漿黏度。W

11、estern blot實驗和HE病理染色的結(jié)果則表明，HSA25、L-PEG-HSA和Y-PEG-HSA三種高滲透性的血容量擴充劑能夠顯著抑制肺組織炎癥相關(guān)因子（TNF-α，NF-κB）和凋亡相關(guān)蛋白(bax，bcl-2)的表達，減輕肺部組織的再灌注損傷。
　　本論文未發(fā)現(xiàn)支鏈PEG修飾的HSA具有療效上的優(yōu)勢。而值得注意的是，血液復蘇結(jié)束后，PEG-HSAs組大鼠血液的血沉方程K值有所增加(L-PEG-HSA，4.38±1.01

12、; Y-PEG-HSA，5.06±0.36)，與生理鹽水組（3.51±0.55）、HSA8（3.24±0.46）和HSA25（3.20±0.81）實驗組相比有顯著性差異，其中Y-PEG-HSA實驗組表現(xiàn)得尤為明顯。另外，與生理鹽水組（0.92±0.08）相比，HSA（HSA8，1.04±0.08;HSA25，1.11±0.28）能夠增加血液紅細胞的變形性指數(shù)，但是PEG修飾會減弱HSA的這一功能，特別是Y形PEG修飾(L-PEG-HSA

13、，1.05±0.04; Y-PEG-HSA，0.95±0.06)。
　　2PEG定點修飾的HSA在溶液中的結(jié)構(gòu)以及藥物結(jié)合性質(zhì)的研究
　　方法:本論文采用小角中子散射的方法研究了直鏈5kDa、10 kDa、20 kDa和40 kDa PEG和支鏈20 kDa、40 kDa PEG定點修飾HSA的Cys34后所得PEG-HSAs聚合物在溶液中的構(gòu)象;還采用表面等離子共振技術(shù)(surface plasmonresonance，S

14、PR)研究不同Mr和不同構(gòu)型的PEG修飾對于臨近HSA Cys34的血紅素結(jié)合位點結(jié)合能力的影響。
　　結(jié)果:HSA、PEG5kD-HSA、PEG10kD-HSA、PEG20kD-HSA、Y-PEG20kD-HSA、PEG40kD-HSA、Y-PEG40kD-HSA的旋轉(zhuǎn)半徑分別為2.27±0.01、2.42±0.04、2.44±0.01、2.52±0.01、2.61±0.02、2.50±0.02、2.60±0.04 nm;分子最

15、大直徑分別為6.22±0.04、6.79±0.1、6.97±0.07、7.07±0.04、7.36±0.11、7.00±0.00、7.49±0.23 nm。這表明，經(jīng)PEG修飾后，HSA在溶液中的構(gòu)象有所延伸擴展，分子直徑增加。支鏈PEG修飾的HSA相對于同等Mr的直鏈PEG修飾的HSA擁有相對更大的旋轉(zhuǎn)半徑(the radii of gyration，Rg)和最大直徑(the maximumdimension ofthe scatte

16、ring particle，Dmax)。Y-PEG40kD-HSA的散射曲線在小q處的干擾峰最為明顯。結(jié)合電泳圖中Y-PEG40kD-HSA比相同Mr的直鏈PEG修飾的PEG40kD-HSA的表觀Mr明顯大很多，表明支鏈PEG的空間結(jié)構(gòu)有較大的空間位阻，也能賦予HSA更強的分子間相互排斥作用。HSA和PEG-HSAs的P(R)函數(shù)的最大峰值M對應的r均在3 nm左右，表明直鏈和支鏈不同Mr的PEG修飾對蛋白質(zhì)自身的結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響。利用

17、DAMMIN對小角散射的數(shù)據(jù)進行重頭建模得到的HSA和PEG-HSA在溶液中的三維構(gòu)象表明，偶聯(lián)在HSA表面的PEG自己形成一個無規(guī)則線團覆蓋在HSA表面上，與HSA更傾向于彼此之間相互影響作用形成一個類似球體的PEG-HSA的復合物。與相同Mr的線性PEG相比，支鏈PEG的兩條鏈雖然連接在同一個末端，但是彼此分別在HSA表面形成兩個獨立的相互排斥的無規(guī)則線團。
　　HSA、 PEG5kD-HSA、 PEG10kD-HSA、 PE

18、G20kD-HSA、Y-PEG20kD-HSA、PEG40kD-HSA、Y-PEG40kD-HSA與血紅素作用的為平衡解離常數(shù)(equilibriumdissociation constant, KD)分別為(5.10±0.70)×10-9、(46.83±3.70)×10-9、(7.75±2.03)×10-9、(9.04±0.42)×10-9、(7.18±1.88)×10-9、(84.43±0.74)×10-9、(26.53±2.87)

19、×10-9mol/L，這表明直鏈PEG5kD、直鏈PEG40kD和支鏈PEG40kD修飾大大降低了HSA和血紅素結(jié)合的親和力，而直鏈PEG10kD、直鏈PEG20kD和支鏈PEG20kD對HSA和血紅素的結(jié)合基本沒有影響。
　　3大鼠血漿中PEG-HSA基于NanoLC-MS/MS的定量分析方法的建立
　　本論文通過采用Nano液相-串聯(lián)質(zhì)譜(nanoliquid chromatography tandemmass chro

20、matography，NanoLC-MS/MS)檢測PEG-HSA經(jīng)酶解后的肽段來對完整的PEG-HSA進行定量，建立了一種新的PEG-HSA在大鼠血漿中含量的測定方法，該方法選擇性好、靈敏度高。采用液液萃取法，利用與水混溶的酸性有機溶劑從血漿中提取待測物PEG-HSA與內(nèi)標PEG-BSA，色譜分析采用自制的納流C18柱（直徑75μm，長度150 mm）。采用PEG-HSA經(jīng)酶解后的HPYFYAPELLFFAK肽段和PEG-BSA酶解后

21、的HPYFYAPELLYYANK肽段進行定量，用于這兩個肽段定量分析的離子反應分別為m/z581.6→779.4和m/z936.0→1491.9。采用甲酸(formic acid，F(xiàn)A)和乙腈(acetonitrile，ACN)作為流動相試劑，流動相A相為0.1％FA/H20、B相為0.1％FA/ACN，流速為300 nl/min，進樣梯度為5 min8％B、45 min35％B、50 min90％B、60 min90％B。在50～30

22、00ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性表現(xiàn)良好，定量下限為50ng/mL，批內(nèi)、批間精密度（以相對標準偏差表示）均小于15％，準確度（以相對誤差表示）在15％以內(nèi)。
　　本論文的創(chuàng)新性以及取得的主要成果和結(jié)論:
　　1.首次考察了20 kDa直鏈和支鏈PEG定點修飾的HSA在大鼠失血性休克模型中作為血容量擴充劑的療效，證實了高MrPEG定點修飾的HSA作為血容量擴充劑的優(yōu)勢，揭示了PEG的高黏性和高滲性分別有助于增加微血管的灌注和減

23、輕肺部缺血再灌注損傷，發(fā)現(xiàn)了支鏈PEG修飾對紅細胞的聚集性和變形性的影響，為PEG修飾劑構(gòu)型的選擇提供一定的理論基礎，同時也為PEG-HSA臨床應用提供重要的參考依據(jù)。
　　2.首次采用小角中子散射技術(shù)研究了不同Mr和不同構(gòu)型的PEG修飾劑在HSA表面的空間取向和對蛋白結(jié)構(gòu)的影響，并首次采用SPR技術(shù)研究其對于臨近Cys34的血紅素結(jié)合位點結(jié)合能力的影響，更好地從理論上解釋了PEG修飾賦予蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的優(yōu)勢，例如分子半徑增加、

24、半衰期延長、免疫原性降低等，同時也為PEG修飾劑Mr、結(jié)構(gòu)和修飾位點的選擇優(yōu)化提供了新的研究方法。
　　3.首次采用NanoLC-MS/MS通過檢測PEG-HSA經(jīng)酶解后的肽段來測定完整的PEG-HSA在大鼠血漿中的濃度，建立了一種新的具有高靈敏度和高選擇性的定量方法，可以解決放射性同位素標記不穩(wěn)定、易脫落以及難以反映藥物真實藥代動力學情況的問題。此方法的專屬性良好，方法的準確度、精密度、提取回收率、基質(zhì)效應、穩(wěn)定性等都符合相關(guān)要