牛半腱肌中多聚磷酸酶酶學(xué)特性及其反應(yīng)體系動(dòng)態(tài)研究.pdf

1、磷酸鹽是肉品加工中常用的品質(zhì)改良劑，且磷酸鹽混合物的作用效果優(yōu)于單一磷酸鹽，但是添加的磷酸鹽在肉品中會(huì)被水解而失去作用。本文從牛肉半腱肌中純化焦磷酸酶和三聚磷酸酶，研究了其酶學(xué)特性，并將純化的酶與單一磷酸鹽和磷酸鹽混合物（TSPP： STPP： HMP=2:1:1）進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)31P NMR技術(shù)鑒別和量化體系中的不同磷酸鹽反應(yīng)物的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，得出如下結(jié)果：
　　 1、牛肉半腱肌中焦磷酸酶分離純化及特性研究
　　 試驗(yàn)

2、建立了牛肉半腱肌中PPase的分離純化方法：將牛肉半腱肌勻漿物經(jīng)0.25M蔗糖和0.6M NaCl提取、50-70％飽和度硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-52離子交換柱層析得到有PPase活性的單峰，經(jīng)SDS-PAGE鑒定得到該酶的分子量為72KDa。以TSPP為底物，對(duì)焦磷酸酶的研究表明該酶初速度反應(yīng)時(shí)間為0-25min，最適pH為6.8，最適溫度為47℃，Mg2+、Ca2+在低濃度條件下對(duì)酶活性影響很大，0-10mM Mg2+酶活性迅速升

3、高，當(dāng)Mg2+濃度高于10mM時(shí)活性達(dá)到穩(wěn)定，低濃度Ca2+抑制活性，當(dāng)濃度達(dá)到25mM時(shí)幾乎檢測(cè)不到活性。當(dāng)濃度低于10mM時(shí)，EDTA-Na4比EDTA-Na2有更強(qiáng)的抑制作用；當(dāng)濃度高于10mM時(shí)抑制作用趨于穩(wěn)定，但與Ca2+的抑制效果不同的是EDTA-Na2和EDTA-Na4沒(méi)有完全抑制活性。
　　 2、牛肉半腱肌中三聚磷酸酶分離純化及特性研究
　　 試驗(yàn)建立了牛肉半腱肌中TPPase的分離純化方法：將半腱肌勻漿

4、物經(jīng)鹽溶液提取、調(diào)離子強(qiáng)度、35％-50％飽和度硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-52離子交換柱層析得到有TPPase活性的單峰，通過(guò)SDS-PAGE鑒定得到該酶的分子量為225KDa，該分子量剛好與肌球蛋白重鏈的分子量一樣.以STPP為底物，對(duì)三聚磷酸酶的作用研究表明該酶的初速度反應(yīng)時(shí)間為0-25min，，最適pH5.8，最適溫度28℃，在0-10mM條件下Mg2+對(duì)酶有較強(qiáng)的激活作用高于10mM濃度的Mg2+對(duì)TPPase活性有維持作用，當(dāng)

5、Ca2+濃度從0增加到1mM時(shí)，酶活性迅速下降，當(dāng)濃度高于8mM時(shí)，活性幾乎不受影響。EDTA-Na2和EDTA-Na4對(duì)酶活性均有抑制作用，當(dāng)濃度低于15mM，EDTA-Na2比EDTA-Na4的有更大的抑制作用。
　　 3、純化的焦磷酸酶和三聚磷酸酶與磷酸鹽反應(yīng)體系的動(dòng)態(tài)研究
　　 將純化的牛肉半腱肌焦磷酸酶和三聚磷酸酶與磷酸鹽進(jìn)行反應(yīng)，采用31P NMR技術(shù)測(cè)定不同時(shí)間下體系中的磷酸鹽存在形式及量的變化，結(jié)果表明：

6、在三聚磷酸酶和焦磷酸酶共同作用下，三聚磷酸鹽水解成焦磷酸鹽，派生的焦磷酸鹽繼續(xù)水解成單磷；在三聚磷酸酶和焦磷酸酶相同活力的條件下，三聚磷酸鹽水解成焦磷酸鹽的速度快于焦磷酸鹽水解成單磷的速度；焦磷酸四鈉、磷酸鹽混合物分別與焦磷酸酶反應(yīng)，后者反應(yīng)體系中焦磷酸鹽積分面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于前者，且單磷峰高遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于前者，表明磷酸鹽混合物抑制了焦磷酸鹽的水解；三聚磷酸鈉、磷酸鹽混合物分別與三聚磷酸酶反應(yīng)，后者反應(yīng)體系中焦磷酸鹽積分面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于前者，且單磷峰高