獸疫鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質酸過程控制與優(yōu)化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、透明質酸(HA)是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖通過β-(1→3)和β-(1→4)糖苷鍵連接而成的粘多糖,具有高保濕性、粘彈性和生物相容性等許多優(yōu)良性質,在生物醫(yī)藥、化妝品和保健食品等領域具有廣泛應用。目前微生物發(fā)酵法已經(jīng)取代動物組織提取法成為生產(chǎn)HA的主要方法,隨著HA市場需求的不斷擴大,有效提高發(fā)酵法生產(chǎn)HA的產(chǎn)率和生產(chǎn)強度至關重要。本論文依據(jù)HA發(fā)酵系統(tǒng)的混合與傳質特性以及生產(chǎn)菌株獸疫鏈球菌Streptococcuszooepide

2、micus自身的生理代謝特性,提出了一系列發(fā)酵優(yōu)化與控制策略,實現(xiàn)了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)HA的高產(chǎn)量、高底物轉化率與高生產(chǎn)強度的相對統(tǒng)一,其主要研究內(nèi)容和結果如下:
   (1)HA發(fā)酵屬于高粘度發(fā)酵,混合性能差和傳質效率低是HA發(fā)酵的一個重要瓶頸,因此優(yōu)化HA發(fā)酵體系的混合與傳質特性至關重要。首先研究了HA發(fā)酵過程的混合與傳質特性,然后運用徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡.具有量子行為的粒子群優(yōu)化算法(RBF-QPSO)對影響混合與傳質特性的三

3、個主要因素(攪拌轉速、通氣速率與攪拌器個數(shù))進行優(yōu)化。得到的優(yōu)化條件為:攪拌轉速294 rpm,通氣速率1,5 vvm,攪拌器個數(shù)3.在此條件下HA產(chǎn)量為5.58 g/L,比優(yōu)化前提高了12%(以5.0 g/L為對照);
   (2)進一步研究發(fā)現(xiàn)在上述優(yōu)化條件下HA發(fā)酵體系仍沒有處于全混合狀態(tài),于是進一步研究了全混合狀態(tài)對HA發(fā)酵的影響。結果表明在全混合狀態(tài)下雖然混合與傳質效率得到明顯提高,但是HA產(chǎn)量反而下降,這可能是因為在

4、全混合狀態(tài)下高攪拌轉速(高剪切力)對細胞的剪切作用較大,降低了細胞的生理代謝活性,表明低剪切、高傳質效率和高溶氧水平是HA發(fā)酵的較理想方式;
   (3)基于上述研究結果,進一步研究了添加氧載體正十二烷對HA發(fā)酵過程的影響,結果表明,當添加的正十二烷濃度為5%(v/v)時,8-16 h期間的平均體積溶氧傳遞系數(shù)(KLa)為37 h-1,是添加前的3.7倍;HA產(chǎn)量達到6.3 g/L,提高了26%;
   (4)在上述研究

5、基礎上進一步探討了在發(fā)酵過程中通過降解HA提高發(fā)酵體系混合與傳質效率的可能性??疾炝嗽诎l(fā)酵過程中添加透明質酸酶對HA發(fā)酵過程的影響,研究結果表明在發(fā)酵過程中添加透明質酸酶降解透明質酸能夠顯著改善發(fā)酵體系的混合與傳質特性,當添加的透明質酸酶濃度為0.25 g/L時,HA分子量由1300 kDa降為21kDa,發(fā)酵體系處于完全混合狀態(tài),KLa為100 h-1,HA產(chǎn)量為6.0 g/L,提高了20%;
   (5)出于對生產(chǎn)成本的考慮

6、,進一步考察了在發(fā)酵過程中同時添加過氧化氫和抗壞血酸對HA發(fā)酵過程的影響,在發(fā)酵8h和12 h兩次添加過氧化氫和抗壞血酸以氧化還原降解HA也能夠顯著改善發(fā)酵體系的混合與傳質特性,當添加的過氧化氫濃度為1.0mmol/g HA、抗壞血酸濃度為0.5 mmol/g HA時,KLa從3.7 h-1提高到49 h-1,HA產(chǎn)量為6.5 g/L,提高了26%;
   (6)基于HA在獸疫鏈球菌中的生理功能以及細胞在脅迫環(huán)境下的物質及能量代

7、謝的應答機理,考察了流加H2O2進行氧化脅迫對HA發(fā)酵過程的影響,研究發(fā)現(xiàn)在分批培養(yǎng)過程中流加H2O2進行氧化脅迫能夠轉變細胞產(chǎn)能途徑、提高細胞產(chǎn)能效率和提高HA合成速率,當H2O2流加速率為0.06 mmol L-1 h-1時,HA的產(chǎn)量達到6.0 g/L,比對照提高了20%;
   (7)提出了一種間歇性pH脅迫策略:前0-6 h期間控制pH為7.0,在6-7 h期間控制pH為8.5,在7-8 h期間控制pH為7.0,在8-

8、9 h期間再將pH調到8.5,如此循環(huán)下去,直至發(fā)酵結束。在此脅迫策略控制下,HA產(chǎn)量提高到6.5 g/L,提高了30%;
   (8)考察了HA發(fā)酵過程中常見氨基酸的代謝動力學,確定精氨酸、半胱氨酸和賴氨酸是影響細胞生長和HA合成的關鍵氨基酸;考察了添加核苷酸堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶)對HA發(fā)酵過程的影響,發(fā)現(xiàn)尿嘧啶對HA發(fā)酵具有重要影響。運用RBF-QPSO算法對關鍵營養(yǎng)因子的添加濃度進行了優(yōu)化,最佳添

9、加濃度為:精氨酸0.062 g/L,半胱氨酸0.036 g/L,賴氨酸0.043 g/L,尿嘧啶0.06 g/L時,在此條件下,HA產(chǎn)量提高到6.3 g/L,提高了26%;
   (9)研究了不同培養(yǎng)模式對HA發(fā)酵過程的影響,發(fā)現(xiàn)采用分批培養(yǎng)可獲得較高的碳源對HA的轉化率,而補料分批培養(yǎng)可獲得較高的細胞比生長速率,于是提出了一種兩階段培養(yǎng)模式:在第一階段內(nèi)(0-8 h)進行指數(shù)流加培養(yǎng),在8h提高碳源濃度至25 g/L,進行第二

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