抗細(xì)菌muraymycin生物合成的調(diào)控機理.pdf

1、Muraymycin是一個潛在的轉(zhuǎn)位酶抑制因子，在細(xì)胞內(nèi)的靶位點是肽聚糖合成中的轉(zhuǎn)位酶(MraY)，因此有較強的抗G+細(xì)菌的作用。其抗菌譜窄，有與現(xiàn)有藥物不同的靶位點，作用機制獨特，目前臨床上尚沒有MraY抑制劑在使用，所以此類抗生素與現(xiàn)用的抗生素不會產(chǎn)生交叉耐藥。因此，muraymycin等尿苷肽類抗生素是尋找新型低毒，窄譜抗菌藥物先導(dǎo)化合物的最佳選擇。Muraymycin最初發(fā)現(xiàn)于2001年，具有相似結(jié)構(gòu)的抗生素有pacidamyc

2、in、caprazamycin、sansanmycin、napsamycin等，2011年其生物合成基因簇被克隆得到。
　　本研究從不同水平上對與muraymycin生物合成相關(guān)的調(diào)控基因mur34、mur33、mur32的功能進行了探索研究。首先，通過PCR-Targeting技術(shù)在同源載體上將mur34與mur32進行基因失活。將mur34突變失活后的pJTU5642載體接合轉(zhuǎn)至Streptomyces lividans TK

3、24宿主中后，成功實現(xiàn)了muraymycin基因簇的異源表達(dá)。通過對pJTU5030上基因簇邊界基因進行失活，確定了抗生素生物合成的最小基因組為mur12到mur33的大片段。染色體基因組上mur34的失活直接導(dǎo)致了菌株發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的抑制活性及muraymycin產(chǎn)量的提高，對突變株進行基因回補后恢復(fù)了菌株的野生型表型。利用實時熒光定量PCR檢測相對轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)mur34突變后基因簇的轉(zhuǎn)錄提高了30多倍。經(jīng)測定分析mur33與

4、mur32組成一個操縱子，利用5'RACE技術(shù)證實mur33-mur32啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點位于起始密碼子上游58個堿基處。然后，在原核宿主BL21(DE3)中對Mur34進行了His標(biāo)簽融合的蛋白表達(dá)，并利用親和層析技術(shù)進行蛋白的制備。通過凝膠遷移試驗以及DNaseⅠ足跡試驗，測定了Mur34與muraymycin基因簇上各啟動子DNA的體外結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)Mur34特異性的結(jié)合在mur33起始密碼子與轉(zhuǎn)錄起始位點中間區(qū)域，暗示了Mur

5、34通過阻止RNA聚合酶復(fù)合物的遷移而抑制mur33-mur32操縱子的轉(zhuǎn)錄。利用兒茶酚-2，3-雙加氧酶活性對野生型及突變型啟動子的活性進行檢測，再次證實Mur34對mur33-mur32的轉(zhuǎn)錄抑制作用，同時確定了-10區(qū)相對于-35區(qū)對啟動子發(fā)揮功能的重要性。另外，對mur32突變株進行發(fā)酵液的抑菌活性、LC-MS以及熒光定量PCR檢測等試驗，確定mur32的突變對muraymycin的生物合成幾乎沒有影響。
　　經(jīng)信息學(xué)分析

6、發(fā)現(xiàn)，Mur33與SsaA的C端DNA結(jié)合域有較高的相似性，是一個調(diào)控因子。利用高保真PCR技術(shù)擴增mur33核酸序列的左右同源臂，經(jīng)酶切后連至pOJ446載體上，構(gòu)建成基因的同框缺失載體pJTU5020，將其通過屬間接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至muraymycin野生型產(chǎn)生菌S.sp.NRRL30471，經(jīng)過染色體同源雙交換后獲得mur33在染色體上的同框缺失突變。對Mur33突變株的發(fā)酵液進行抑菌活性和LC-MS檢測分析，發(fā)現(xiàn)mur33突變后菌株對

7、枯草芽孢桿菌的抑制活性降低，幾乎失去了muraymycin的產(chǎn)生能力。利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，mur33突變后基因簇的轉(zhuǎn)錄水平大幅度降低。另外，對mur33突變株進行基因回補后恢復(fù)了菌株的野生型表型。
　　構(gòu)建mur33的NusA融合蛋白載體，并用自誘導(dǎo)型培養(yǎng)基ZYM5052對蛋白表達(dá)菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，成功獲得了Mur33的可溶性表達(dá)。同時設(shè)置2個負(fù)對照(NusA標(biāo)簽和空載菌株蛋白)，以及非特異性poly dI-dC和

8、競爭性探針，對Mur33融合蛋白與啟動子DNA的體外結(jié)合活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)其與mur12-mur31啟動子DNA有較高的結(jié)合活性，而muraymycin生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)都受控于mur12-mur31啟動子。因此，確定Mur33作為關(guān)鍵的正調(diào)控因子激活muraymycin的生物合成。
　　綜上，在muraymycin生物合成的途經(jīng)特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Mur34接受上游調(diào)控因子傳來的信號，通過阻止必需的正調(diào)控因子Mur33的轉(zhuǎn)