SD大鼠主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞自發(fā)鈣化模型的建立及阿托伐他汀和氨氯地平的影響.pdf

1、鈣化性主動脈瓣疾病是一個慢性進(jìn)展性疾病，包括早期的主動脈瓣硬化(aortic sclerosis，ASc)和晚期的鈣化性主動脈瓣狹窄(calcific aortic valvestenosis，CAS)。在歐、美等發(fā)達(dá)國家，CAS已成為成人最常見的心臟瓣膜??；且患者一旦出現(xiàn)臨床癥狀，預(yù)后較差。隨著研究的深入，對CAS的認(rèn)識逐漸從“與年齡相關(guān)的退行性過程”過渡到認(rèn)為其是“主動調(diào)節(jié)的慢性炎癥過程”。臨床來源的的主動脈瓣標(biāo)本數(shù)量有限，且鈣化較

2、嚴(yán)重；用豬、兔等建立的動物模型，耗時較長且較繁瑣，故建立有效的體外疾病模型顯得尤為重要。
　　主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞(aortic valve interstitial cells，AVICs)在CAS發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前用于CAS研究的AVICs多來源于豬，但由于缺乏相應(yīng)一抗，使研究受限。在有關(guān)CAS的體外研究中，多通過不同種類或濃度的鈣化誘導(dǎo)劑或刺激因子誘導(dǎo)AVICs鈣化，這使得試驗間結(jié)論的可比性較差。SD大鼠是一種常用的實驗

3、動物，具有體積小、易飼養(yǎng)、易購買等優(yōu)點(diǎn)。目前以SD大鼠為研究對象對CAS進(jìn)行的研究較少，可能與大鼠主動脈瓣較小，不易分離培養(yǎng)有關(guān)。
　　本研究欲分離培養(yǎng)SD大鼠AVICs，并觀察其在未給予鈣化誘導(dǎo)劑或刺激因子的情況下，隨著培養(yǎng)時間的延長是否自發(fā)形成鈣化灶；并檢測鈣化過程中鈣化相關(guān)因子的表達(dá)情況，同時觀察阿托伐他汀及氨氯地平對自發(fā)鈣化的影響。
　　第一部分 SD大鼠主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)
　　目的：建立快速有效的SD大

4、鼠AVICs體外培養(yǎng)方法。
　　方法：通過組織塊法分離培養(yǎng)SD大鼠AVICs，觀察細(xì)胞原代及傳代后生長特性；并通過IF染色方法檢測a-SMA及vimentin表達(dá)情況；通過SEM和TEM對細(xì)胞表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果：
　　1、原代培養(yǎng)2～3天后，部分組織塊周邊有細(xì)胞爬出，呈梭形、三角形或不規(guī)則形；原代培養(yǎng)7～8天后，細(xì)胞可達(dá)到70～80％融合，進(jìn)行傳代。
　　2、AVICs經(jīng)IF檢測陽性，即SD大鼠A

5、VICs表達(dá)a-SMA及vimentin。
　　3、經(jīng)SEM檢測可見，細(xì)胞貼壁良好，多邊形，體積較大，細(xì)胞膜較薄且充分伸展。
　　4、經(jīng)TEM檢測可見，細(xì)胞體積較大，不規(guī)則形，可見絨毛；胞內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見大量擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及與細(xì)胞長軸平行的肌絲；細(xì)胞核不規(guī)則，可見核仁。
　　結(jié)論：
　　1、通過組織塊法對SD大鼠AVICs進(jìn)行培養(yǎng)，方法簡單快速。
　　2、經(jīng)過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)鑒定，SD大鼠AVICs為

6、肌成纖維細(xì)胞。
　　第二部分 SD大鼠主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞自發(fā)鈣化模型的建立
　　目的：觀察體外分離培養(yǎng)的SD大鼠AVICs是否可以自發(fā)形成鈣化灶。
　　方法：通過組織塊法分離培養(yǎng)SD大鼠AVICs，對不同培養(yǎng)時間的AVICs進(jìn)行Von Kossa及茜素紅染色、細(xì)胞內(nèi)及其間質(zhì)鈣離子檢測，評價其是否可以自發(fā)形成鈣化灶。
　　結(jié)果：
　　1、培養(yǎng)至4～6天時，AVICs逐漸聚集成團(tuán)，稱為“細(xì)胞灶”，此時細(xì)胞灶較小，

7、散在分布；隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞灶體積逐漸增加，中心區(qū)亮度增加。
　　2、Von Kossa染色顯示，6天時細(xì)胞灶染色陽性，即細(xì)胞灶處有鈣鹽沉積；并且12天時陽性細(xì)胞灶個數(shù)及強(qiáng)度均大于6天組。
　　3、茜素紅染色顯示，6天時細(xì)胞灶染色陽性，即細(xì)胞灶處有鈣鹽沉積；并且12天時陽性細(xì)胞灶個數(shù)及強(qiáng)度均大于6天組。經(jīng)統(tǒng)計分析顯示，茜素紅含量組間有統(tǒng)計學(xué)差異(F=106.167，P<0.001)，0天及6天組茜素紅含量較低，12天組

8、茜素紅含量較高，即隨著培養(yǎng)時間的增加鈣鹽沉積增加。
　　4細(xì)胞及間質(zhì)鈣含量經(jīng)統(tǒng)計分析顯示，鈣離子含量組間有統(tǒng)計學(xué)差異(F=116.379，P<0.001)，0天及6天組鈣離子含量較低，12天組鈣離子含量較高，即隨著培養(yǎng)時間的增加鈣鹽沉積增加。
　　結(jié)論：通過延長細(xì)胞培養(yǎng)時間能夠誘導(dǎo)其自發(fā)形成鈣化灶。
　　第三部分 SD大鼠主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞自發(fā)鈣化模型的機(jī)制研究
　　目的：檢測AVICs在自發(fā)鈣化過程中某些成骨相關(guān)

9、基因的表達(dá)情況。
　　方法：通過組織塊法分離培養(yǎng)SD大鼠AVICs，用RT-PCR和western-blot方法，檢測不同培養(yǎng)時間細(xì)胞的ALP活性、成骨相關(guān)因子(α-SMA、Cbfa1、Osteocalcin、ALP、BMP-2、BMP-4)mRNA及蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、ALP活性檢測結(jié)果表明，0天、6天、12天組ALP活性有統(tǒng)計學(xué)差異(x2=139.396，P<0.001)，12天組ALP活性最低，0

10、天組ALP活性較高，6天組ALP活性最高，即隨著培養(yǎng)時間的增加，ALP活性從0天開始逐漸升高，至第6天達(dá)峰，之后逐漸下降。
　　2、Cbfa1 mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4 mRNA、ALP mRNA、BMP-2mRNA、α-SMA mRNA RT-PCR檢測結(jié)果
　　2.1 Cbfa1 mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4 mRNA RT-PCR結(jié)果表明，0天、6天、12天組Cb

11、fa1 mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4 mRNA表達(dá)水平有統(tǒng)計學(xué)差異(F=410.106，x2=7.200，F(xiàn)=38.463，P<0.005)，0天組最低，6天組較高，12天組最高，即隨著培養(yǎng)時間的增加Cbfa1 mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4 mRNA表達(dá)水平逐漸增高。
　　2.2 ALP mRNA RT-PCR結(jié)果表明，0天、6天、12天組ALP mRNA表達(dá)水平有統(tǒng)計學(xué)差異(x

12、2=7.200，P=0.027)，0天最低，12天較高，6天最高，即隨著培養(yǎng)時間的增加，ALP mRNA的表達(dá)水平先增加后下降。
　　2.3 BMP-2 mRNA RT-PCR結(jié)果表明，0天、6天、12天組BMP-2 mRNA表達(dá)水平有統(tǒng)計學(xué)差異(F=56.565，P<0.001)，0天組較低，6天組和12天組較高，即隨著培養(yǎng)時間的增加，BMP-2 mRNA的表達(dá)水平逐漸增加。
　　2.4α-SMA mRNA RT-PCR結(jié)

13、果表明，0天、6天、12天組α-SMA mRNA表達(dá)水平有統(tǒng)計學(xué)差異(F=89.886，P<0.001)，12天最低，6天較高，0天最高。隨著培養(yǎng)時間的增加α-SMA mRNA的表達(dá)水平逐漸下降。
　　3、ALP、BMP-2、BMP-4 western-blot結(jié)果
　　3.1 ALP western-blot結(jié)果表明，0天、6天、12天組ALP蛋白表達(dá)水平有統(tǒng)計學(xué)差異(x2=7.261，P=0.027)，0天組最低，12天

14、組較高，6天組最高，即隨著培養(yǎng)時間的增加，ALP蛋白表達(dá)先增高后降低。
　　3.2 BMP-2、BMP-4 western-blot結(jié)果表明，0天、6天、12天組BMP-2、BMP-4蛋白表達(dá)水平有統(tǒng)計學(xué)差異(x2=7.200，F(xiàn)=452.482，P<0.05)，0天組最低，6天組較高，12天組最高，即隨著培養(yǎng)時間的增加BMP-2、BMP-4蛋白表達(dá)逐漸增高。
　　結(jié)論：AVICs向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化可能是自發(fā)鈣化模型形成的細(xì)

15、胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　第四部分阿托伐他汀和氨氯地平對SD大鼠主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞自發(fā)鈣化的影響
　　目的：觀察阿托伐他汀和氨氯地平對SD大鼠AVICs自發(fā)鈣化的影響。
　　方法：采用組織塊法分離培養(yǎng)SD大鼠AVICs，檢測不同濃度的阿托伐他汀和氨氯地平對AVICs自發(fā)鈣化程度及ALP活性的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1、通過延長培養(yǎng)時間，各組均形成直徑大小不同的鈣化灶。
　　2、Ato和Aml對AVICs自發(fā)鈣

16、化程度的影響
　　2.1在控制了組別因素的情況下，時間因素在不同水平有統(tǒng)計學(xué)差異：0天和6天較低，12天較高(F=116.379，P<0.001)，即隨著培養(yǎng)時間的增加各組Ca2+含量均逐漸增高。
　　2.2在控制了時間因素的情況下，組別問有統(tǒng)計學(xué)差異，10-6mol/L Aml組比10-6mol/L Ato組鈣含量高，兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異(F=3.655，P=0.023)，其他組間均無統(tǒng)計學(xué)差異，即在相同的培養(yǎng)時間情況下，除

17、10-6mol/L Aml組和10-6mol/L Ato組Ca2+含量有差別外(10-6mol/L Aml組Ca2+含量高于10-6mol/L Ato組)，其余各組均無差別。
　　3、Ato和Aml對ALP的影響
　　3.1在控制了組別因素的情況下，時間因素在不同水平有統(tǒng)計學(xué)差異：12天最低，0天較高，6天最高(F=139.396，P<0.001)，即隨著培養(yǎng)時間的增加各組ALP活性先增加后降低。
　　3.2在控制了時