基因組重排在產(chǎn)纖維素酶斜臥青霉菌種改造中的應(yīng)用.pdf

1、隨著資源短缺、環(huán)境污染和能源危機(jī)的加劇，尋找和開(kāi)發(fā)可以代替化石能源的新能源就成了亟待解決的問(wèn)題。纖維素是地球上分布最廣、含量最豐富的可再生資源，纖維素酶可以將可再生的木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的多糖、單糖等混合糖漿，進(jìn)一步發(fā)酵生產(chǎn)為乙醇等清潔能源物質(zhì)或者其它高值生物化學(xué)產(chǎn)品。在第二代生物乙醇工業(yè)或中，其中纖維素酶的成本，是纖維素乙醇商品化的一個(gè)重要制約因素。
　　 斜臥青霉JU-A10是我們實(shí)驗(yàn)室由斜臥青霉114-2通過(guò)多輪誘變得到

2、的抗阻遏突變株，其本身除了纖維素酶外也可以產(chǎn)生大量的半纖維素酶，對(duì)降解結(jié)構(gòu)復(fù)雜的木質(zhì)纖維素有很好的應(yīng)用前景。但是其纖維素酶生產(chǎn)能力仍不能滿足工業(yè)要求。而目前，我們對(duì)斜臥青霉的遺傳背景和纖維素酶合成機(jī)制不夠清楚，也沒(méi)有合適的遺傳改造工具，所以通過(guò)理性設(shè)計(jì)改造菌株在操作上有一定的難度。本文通過(guò)近幾年發(fā)展起來(lái)并廣泛應(yīng)用的基因組重排技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造，主要獲得了以下結(jié)果：
　　 1、建立了高效的纖維素雙層平板篩選方法
　　 優(yōu)化了

3、雙層平板中培養(yǎng)基的組成，確定了使用球磨微晶纖維素和葡萄糖作為篩選纖維素酶高產(chǎn)突變株的選擇壓力，建立了水解圈大小和纖維素酶活正相關(guān)的高效的纖維素雙層平板篩選方法。JU-A10只可以在2％球磨微晶纖維素和低于1％葡萄糖的雙層平板上產(chǎn)生纖維素水解圈，所以在篩選過(guò)程中，逐步提高纖維素和葡萄糖的濃度可進(jìn)一步篩選到纖維素降解能力更強(qiáng)或是抗阻遏能力更高的突變株。
　　 2、建立了斜臥青霉原生質(zhì)體制備、再生和雙親滅活原生質(zhì)體融合方法
　　

4、 建立了高效的斜臥青霉原生質(zhì)體制備和再生的方法：在優(yōu)化后的菌絲培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌絲24 h后，經(jīng)2 mg ml-1溶壁酶、4 mg ml-1纖維素酶、4 mg ml-1蝸牛酶三種酶酶解菌絲后，得到的原生質(zhì)體經(jīng)純化后，原生質(zhì)體的再生比率可達(dá)90％以上。
　　 建立了雙親本滅活原生質(zhì)體融合方法：原生質(zhì)體在紫外照射30 min或50℃熱滅活50 min后，失去再生能力。將這兩種方法滅活后的原生質(zhì)體混合在一起，于35％PEG、10 mM

5、Ca2+、35℃的條件下進(jìn)行融合。經(jīng)這兩種不同滅活方法處理過(guò)的原生質(zhì)體，會(huì)在融合過(guò)程中通過(guò)互補(bǔ)，再生出融合子。
　　 3、通過(guò)基因組重排技術(shù)得到了纖維素酶活和產(chǎn)量顯著提高的融合子
　　 使用紫外-EMS復(fù)合誘變和N+離子注入誘變兩種方法，經(jīng)過(guò)纖維素雙層平板初篩和搖瓶復(fù)篩，得到了4株相對(duì)于出發(fā)株JU-A10各有優(yōu)勢(shì)的突變株，滿足了基因組重排所要求的初始親本庫(kù)的多樣性。然后，我們以這四株突變株作為第一輪基因組重排的親本，進(jìn)行

6、重排操作，在篩選平板SM2(2％纖維素、2％葡萄糖)上挑選能夠快速產(chǎn)生水解圈的突變株，通過(guò)復(fù)篩后得到6株酶活進(jìn)一步提高的融合子。以此這6株菌作為第二輪基因組重排的親本，通過(guò)在篩選平板SM3(5％纖維素、2％葡萄糖)的初篩和搖瓶復(fù)篩，最終獲得3株纖維素酶顯著提高的融合子：GS2-15、GS2-21、GS2-22，它們可以在復(fù)篩培養(yǎng)基中產(chǎn)生相當(dāng)于JU-A10200％、209％、194％的纖維素酶活。
　　 4研究并分析了融合子GS2

7、-15、GS2-21、GS2-22與出發(fā)株JU-A10差異
　　 通過(guò)對(duì)融合子和出發(fā)株進(jìn)行了固體平板培養(yǎng)時(shí)菌落、孢子、液體培養(yǎng)時(shí)菌絲的形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果表明：與出發(fā)株相比，融合子的菌落變小，孢子體積變大，孢子壁變薄；在液體培養(yǎng)時(shí)菌絲變細(xì)，在培養(yǎng)后期菌絲更易斷裂成小段，初步推測(cè)其在液體培養(yǎng)時(shí)形態(tài)學(xué)的變化，有利于纖維素酶的大量分泌。
　　 通過(guò)優(yōu)化隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)反應(yīng)體系和程序，建立了斜臥青霉RAPD反應(yīng)體系，

8、對(duì)3個(gè)融合子和JU-A10的RAPD指紋圖譜進(jìn)行了分析。3個(gè)融合子大部分RAPD條帶與JU-A10相同，但是它們之間及它們和JU-A10之間也出現(xiàn)了一些特異性條帶。通過(guò)遺傳相似系數(shù)的計(jì)算和聚類分析，融合子和出發(fā)株以遺傳相似系數(shù)0.87為域閥值，分為三類：第一類群由出發(fā)株JU-A10和融合子GS2-22組成；第二類群、第三類群分別為GS2-15和GS2-21。這反映出融合子在分子水平上發(fā)生了變異。
　　 特別研究了融合子和出發(fā)株在

9、以木糖渣為碳源時(shí)的胞外和胞內(nèi)纖維素酶活、蛋白濃度和生物量等特征，結(jié)果表明：融合子生長(zhǎng)旺盛，并且生物量略高于出發(fā)株，其蛋白濃度和纖維素酶活也明顯高于出發(fā)株；同時(shí)發(fā)現(xiàn)融合子的胞內(nèi)纖維素酶在發(fā)酵初期就大量合成。推測(cè)融合子的纖維素酶活提高可能是由于生長(zhǎng)旺盛，更早的纖維素酶合成和更高的蛋白分泌能力等因素綜合作用所致。
　　 此外，在阻遏條件下(2％葡萄糖為唯一碳源)，融合子比出發(fā)株表現(xiàn)更優(yōu)越。融合子基本上一天就可以耗盡葡萄糖，并且生物量和

10、纖維素酶活高于出發(fā)株。分析和比較了基因組重排后融合子和出發(fā)株的胞外蛋白SDS-PAGE和內(nèi)切酶活性電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)不論是在誘導(dǎo)還是阻遏情況下，融合子的胞外蛋白與出發(fā)株大體相似，但是有個(gè)別蛋白條帶的增減，某些內(nèi)切酶活性條帶表達(dá)增強(qiáng)。這些蛋白表達(dá)的差異反映了融合子在蛋白水平發(fā)生了變化。
　　 5、研究了融合子利用木質(zhì)纖維素為碳源及5-L發(fā)酵罐產(chǎn)酶情況
　　 以木質(zhì)纖維素玉米秸粉、麥秸粉、甘蔗渣作為底物，研究了基因組重排后融合子

11、和出發(fā)株的產(chǎn)酶情況，發(fā)現(xiàn)融合子在較短的時(shí)間內(nèi)就可以產(chǎn)生大量的酶，并且其纖維素酶活和木聚糖酶活與出發(fā)株相比都有顯著提高。
　　 進(jìn)行5-L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)時(shí)，融合子的纖維素酶合成更快，并且酶活進(jìn)一步提高，但是在后期pH會(huì)上升到中性從而導(dǎo)致酶活迅速下降，不利于實(shí)際生產(chǎn)。為解決此問(wèn)題，我們以融合子GS2-15為實(shí)驗(yàn)菌株優(yōu)化了500 ml搖瓶中緩沖劑的種類和劑量，其中以0.08％CaCO3作為緩沖劑成本最低，效果最好。通過(guò)進(jìn)行5-L發(fā)酵罐的驗(yàn)

12、證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液pH和酶活在整個(gè)發(fā)酵中后期保持穩(wěn)定，濾紙酶活可以達(dá)到15.04 FPU ml-1，達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平；胞外蛋白濃度達(dá)到5.81 mg ml-1；纖維素內(nèi)切酶最高為133.12 IU ml-1；β-葡萄糖苷酶酶活最高為5.18 IU ml-1；木聚糖酶酶活最高為411.34IU ml-1。
　　 6、β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株斜臥青霉Peni-1的β-葡萄糖苷酶基因的克隆，酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)研究
　　 Peni

13、-1是本實(shí)驗(yàn)室篩選到的一株β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)的斜臥青霉菌株。我們克隆了Peni-1的β-葡萄糖苷酶的基因，基因含有5個(gè)內(nèi)含子，基因編碼區(qū)全長(zhǎng)2586，編碼861個(gè)氨基酸，與GS2-15相比有三個(gè)氨基酸序列的差異，分別是第2位的Lys→Arg，482位的Gly→Ser，489位的Val→Ile。純化了Peni-1的β-葡萄糖苷酶，并研究了其酶學(xué)性質(zhì)，其最適反應(yīng)溫度為70℃；在60℃保溫12 h后，酶活能保留80％以上；最適作用pH為5；比

14、活為129.6 IU mg-1；以水楊素為底物時(shí)Km值為2.6 mmol L-1；以pNPG為底物時(shí)Km值為0.2mmol L-1。與GS2-15的胞外蛋白SDS-PAGE相比，Peni-1有些蛋白條帶消失，有些蛋白條帶表達(dá)加強(qiáng)。Peni-1的β-葡萄糖苷酶本身性質(zhì)變化不大，所以我們推測(cè)Peni-1可能是由于β-葡萄糖苷酶合成調(diào)控機(jī)制發(fā)生了變化，導(dǎo)致可以分泌表達(dá)大量的β-葡萄糖苷酶蛋白。
　　 7、斜臥青霉濾紙酶活與β-葡萄糖苷