斜臥青霉木質(zhì)纖維素酶系的合成調(diào)控研究.pdf

1、目前，木質(zhì)纖維素降解酶系己廣泛地應(yīng)用于能源、紡織、印染、造紙、洗滌、食品、飼料、釀酒等多個(gè)行業(yè)，顯示了巨大的市場潛力。隨著資源短缺、環(huán)境污染和能源危機(jī)的加劇，利用廉價(jià)的木質(zhì)纖維素類可再生資源生產(chǎn)液體燃料和生物化工產(chǎn)品，不僅能夠節(jié)糧代糧，緩解能源危機(jī)，同時(shí)還可以保護(hù)環(huán)境，促進(jìn)全球經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。但木質(zhì)纖維素酶系的產(chǎn)量和酶的比活力低，以及酶系組成不合理一直是制約木質(zhì)纖維素酶系實(shí)際應(yīng)用的重要原因。就我們的理解，木質(zhì)纖維素、生物質(zhì)降解酶和微生

2、物這三個(gè)要素構(gòu)成一個(gè)動(dòng)態(tài)互作系統(tǒng)，深入研究每個(gè)要素及其之間的關(guān)系是提高生物質(zhì)能源的生產(chǎn)能力、緩解能源危機(jī)的便捷之路。在這三個(gè)要素中，人們對微生物的關(guān)注主要集中于優(yōu)良菌株的選育和改良，包括菌株的篩選和誘變。目前用到的方法有常規(guī)理化誘變、基因組重排、細(xì)胞融合和分子插入誘變等，但這些方法都屬于隨機(jī)的菌株改良策略，不僅工作量大，而且沒有針對性。具有針對性的菌株的定向工程改良近來受到人們的重視，但其前提是弄清酶的合成調(diào)控機(jī)制。因此，研究微生物木質(zhì)

3、纖維素酶系的合成與調(diào)控不僅具有重要的理論意義，而且有助于通過改進(jìn)營養(yǎng)策略和生物過程設(shè)計(jì)或通過定向工程改良，提高酶的生產(chǎn)和應(yīng)用。 研究表明，不同來源的木質(zhì)纖維素酶系的酶系組成及合成調(diào)控機(jī)理往往存在差異，而目前國內(nèi)外的研究主要圍繞木霉和曲霉的合成調(diào)控展開的，對其它絲狀真菌尤其是青霉木質(zhì)纖維素酶系合成調(diào)控的研究較少。本論文從改進(jìn)木質(zhì)纖維素、生物質(zhì)降解酶和微生物這一動(dòng)態(tài)互作系統(tǒng)的角度出發(fā)，以我們實(shí)驗(yàn)室選育的斜臥青霉為實(shí)驗(yàn)材料，研究了其木

4、質(zhì)纖維素酶系的合成調(diào)控機(jī)理，豐富了對相關(guān)領(lǐng)域的認(rèn)識，同時(shí)為菌株的定向工程改良和生物過程設(shè)計(jì)，提供了可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依椐。本論文的主要研究結(jié)果如下： 1、克隆了青霉木質(zhì)纖維素酶系合成調(diào)控因子基因creA與acel，初探了菌株JU-A10的抗降解物阻遏突變機(jī)理利用TAIL-PCR和RT-PCR技術(shù)克隆了青霉木質(zhì)纖維素酶系合成調(diào)控因子編碼基因creA與acel。creA基因全長為1251 bp，不含有內(nèi)含子，編碼417個(gè)氨基酸。C

5、REA蛋白理論分子量和等電點(diǎn)分別為44956,072 Da和pI 9,735。acel基因全長為2836 bp，含有3個(gè)內(nèi)含子，大小分別為129 bp、165 bp和58 bp。acel基因共編碼827個(gè)氨基酸。ACE I蛋白的理論分子量和等電點(diǎn)分別為89871.29 Da和pI 5.685。轉(zhuǎn)錄分析表明斜臥青霉的creA與acel基因是組成性表達(dá)的。通過對斜臥青霉114-2及其突變菌株JU-A10的creA與acel基因的序列和轉(zhuǎn)錄比

6、較發(fā)現(xiàn)，兩菌株的creA與acel基因的序列和轉(zhuǎn)錄情況相同。因此，菌株JU-A10的抗降解物阻遏特征不是由于碳源代謝抑制因子CRE A或．ACE I的突變而引起的。結(jié)合已有的知識和分析，菌株JU-A10的脫阻遏特征應(yīng)該是由產(chǎn)能代謝發(fā)生了變化引起的。 2、揭示了斜臥青霉基礎(chǔ)性與誘導(dǎo)性纖維素酶的組成及區(qū)別通過對誘導(dǎo)與阻遏條件下斜臥青霉胞外纖維素酶活力測定和活性染色進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)斜臥青霉的胞外存在基礎(chǔ)性纖維素酶，基礎(chǔ)性纖維素酶由內(nèi)切葡

7、聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成。其中基礎(chǔ)性與誘導(dǎo)性表達(dá)的內(nèi)切葡聚糖酶組分是不同的，部分誘導(dǎo)性內(nèi)切葡聚糖酶組分只有在誘導(dǎo)條件下才合成。轉(zhuǎn)錄分析表明，斜臥青霉的主要纖維素酶基因cbh1、cbh2、egll、egl2和bgl1均存在低水平的基礎(chǔ)性轉(zhuǎn)錄，除了β-葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶外，只有部分內(nèi)切葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行了翻譯并分泌到胞外，這部分組分才是真正的基礎(chǔ)性內(nèi)切葡聚糖酶。 基礎(chǔ)性內(nèi)切葡聚糖酶由4個(gè)組分組成，分子量大小

8、分別為43 kDa，39 kDa、36 kDa和34 kDa。其中34 kDa蛋白是最先表達(dá)的關(guān)鍵基礎(chǔ)性內(nèi)切葡聚糖酶。對純化的34 kDa基礎(chǔ)性內(nèi)切葡聚糖酶和45 kDa誘導(dǎo)性內(nèi)切葡聚糖酶的性質(zhì)比較顯示，斜臥青霉中基礎(chǔ)性的與誘導(dǎo)性的內(nèi)切葡聚糖酶不是由同一基因編碼。 3、純化了斜臥青霉的主要纖維素酶組分并構(gòu)建了其肽質(zhì)量指紋圖譜庫利用多種色譜分離技術(shù)相結(jié)合方法從斜臥青霉114-2發(fā)酵液中分離得到了1個(gè)純?chǔ)?葡萄糖苷酶和6個(gè)內(nèi)切葡聚糖

9、酶組分。β-葡萄糖苷酶的分子量大小為124kDa。其對底物水楊素的Km值為0.0007 mol/L。β-葡萄糖苷酶最適作用溫度和pH分別為65℃和pH 4-5。6個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶的分子量大小分別約為100 kDa、60 kDa、49 kDa、45 kDa、34 kDa和24 kDa。其中45 kDa和34 kDa內(nèi)切葡聚糖酶達(dá)到了電泳純，二者對底物CMC-Na的Km值分別為0.7793 g/L 和0.8365g/L。45 kDa與34 k

10、Da內(nèi)切葡聚糖酶的最適作用溫度均為55-60℃，最適作用pH分別為pH 4.5和pH 5.0。這2種內(nèi)切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶在50℃以下及偏酸性的條件下能保持較好的穩(wěn)定性。通過將純化的纖維素酶進(jìn)行SDS-PAGE后膠內(nèi)酶解和MALDI-TOF質(zhì)譜分析，并結(jié)合對斜臥青霉纖維素酶基因或基因片段編碼蛋白序列的分析，構(gòu)建了斜臥青霉纖維素酶的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)庫。本PMF庫中包含1種β-葡萄糖苷酶、6種內(nèi)切葡聚糖酶和2種外切葡聚糖酶的肽

11、質(zhì)量指紋圖。 4、建立了斜臥青霉胞外差異蛋白組研究技術(shù)體系通過條件優(yōu)化，建立了穩(wěn)定可靠的斜臥青霉胞外蛋白的雙向電泳實(shí)驗(yàn)方法。比較誘導(dǎo)與阻遏條件下斜臥青霉114-2胞外蛋白的雙向電泳圖譜發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)與阻遏條件下共同存在的蛋白點(diǎn)約23個(gè)，而在誘導(dǎo)條件下，斜臥青霉胞外蛋白的種類和數(shù)量較阻遏條件下明顯增多，多出的蛋白點(diǎn)近40個(gè)。 我們比較了三種蛋白鑒定方法：一種是采用MASCOT搜索引擎對蛋白的PMF在NCBInr數(shù)據(jù)庫中檢索；

12、第二種是通過軟件GPMAW 6.0或手工方法對蛋白的PMF在我們構(gòu)建的斜臥青霉纖維素酶的PMF數(shù)據(jù)庫中檢索。第三種是采用MASCOT搜索引擎對串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果在NCBInr數(shù)據(jù)庫中檢索。通過比較，驗(yàn)證了通過純化蛋白構(gòu)建數(shù)據(jù)庫用于蛋白鑒定的方法可行性。采用這種方法，我們共鑒定出2個(gè)β-葡萄糖苷酶、13個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶。其中2個(gè)β-葡萄糖苷酶和2個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶是基礎(chǔ)性表達(dá)的。 5、分析了麥麩中各組分對斜臥青霉生物質(zhì)降解酶系合成的影響，找出

13、了促進(jìn)纖維素酶合成的關(guān)鍵因子之一是可溶性的纖維類寡糖在不同成分含量的碳源培養(yǎng)條件下，通過測定斜臥青霉菌體生長量和胞外生物質(zhì)降解酶活力發(fā)現(xiàn)：麥麩中的淀粉可以誘導(dǎo)斜臥青霉淀粉酶的合成，但不能提供菌體生長需要的生長因子，過量時(shí)會(huì)抑制纖維素酶與木聚糖酶的合成。麥麩中的蛋白能幫助斜臥青霉生長，但添加過量蛋白也會(huì)抑制斜臥青霉纖維素酶、木聚糖酶與蛋白酶的合成。麥麩中的木聚糖可以誘導(dǎo)斜臥青霉纖維素酶與木聚糖酶的合成，但對纖維素酶的誘導(dǎo)能力明顯低于對木聚