斜臥青霉胞外蛋白質(zhì)組學(xué)分析與纖維素酶合成調(diào)控機制研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上產(chǎn)量巨大而又未得到充分利用的可再生資源。在石油資源日趨枯竭和環(huán)境惡化的嚴峻形勢下，發(fā)展生物質(zhì)能源，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)液體燃料和化工產(chǎn)品，不僅可以減緩石油消耗，緩解能源資源緊缺，同時還可以保護環(huán)境，促進全球經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶分解和轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素是纖維素利用的有效途徑。絲狀真菌所產(chǎn)生的纖維素酶多是胞外酶，便于分離和提取，且所產(chǎn)生的纖維素酶各組分較為齊全，適宜用于工業(yè)化生產(chǎn)。但纖維素酶的效率低、成本高

2、是大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用中的主要瓶頸。對絲狀真菌纖維素酶酶系組成及其合成調(diào)控機制的研究對于提高酶的產(chǎn)量和活性都具有重要的意義。
　　 目前國內(nèi)外對絲狀真菌纖維素酶的研究主要圍繞木霉和曲霉展開，應(yīng)用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等技術(shù)在酶系組成、合成調(diào)控等方面取得了一定進展，而對其它絲狀真菌纖維素酶系組成和合成調(diào)控研究較少，尤其是青霉屬真菌。本論文以實驗室篩選的斜臥青霉為研究對象，對其胞外酶系組成進行了研究，比較了野生菌株和高產(chǎn)突變菌株在

3、不同培養(yǎng)條件下纖維素降解酶系基因轉(zhuǎn)錄情況和胞外蛋白產(chǎn)生情況，并對兩個可能與突變菌株高產(chǎn)性狀相關(guān)的基因進行了初步功能分析。這些研究有助于深入認識斜臥青霉的胞外酶系組成和纖維素酶表達調(diào)控機制，對進一步開展菌株改造具有一定借鑒意義。
　　 本論文的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.克隆了斜臥青霉內(nèi)切葡聚糖酶基因ce15A與ce17B，并在釀酒酵母中進行了異源表達，研究了重組酶的酶學(xué)性質(zhì):采用簡并PCR和TAIL-PCR技術(shù)克隆了斜

4、臥青霉的兩個內(nèi)切葡聚糖酶基因ce15A和ce17B。ce15A基因全長為1549 bp，含有3個內(nèi)含子。ce15A cDNA包含一個長度為1236 bp的開放閱讀框，編碼411個氨基酸。ce17B基因全長為1425 bp，不含有內(nèi)含子，編碼474個氨基酸。Southern雜交結(jié)果表明，ce15A和ce17B基因在染色體上均以單拷貝形式存在。熒光實時定量PCR轉(zhuǎn)錄分析表明，ce15A和ce17B基因轉(zhuǎn)錄是共調(diào)控的，均受葡萄糖的抑制和纖維素

5、的誘導(dǎo)。構(gòu)建了ce15A和ce17B基因在釀酒酵母中表達的重組質(zhì)粒，并成功表達和純化了兩個重組酶。重組Ce15A和Cel7B最適作用均為60℃，最適作用pH均為4。重組Cel7B降解CMC、大麥β-葡聚糖和磷酸膨脹纖維素的活性分別是Ce15A的8倍、30倍和5倍，但是降解微晶纖維素的能力兩個酶相差不大，且Ce15A降解微晶纖維素的產(chǎn)物主要為纖維二糖和痕量葡萄糖。這些結(jié)果說明相對Ce15A，Ce17B是更為嚴格的內(nèi)切葡聚糖酶。
　　

6、 2.分析了不同碳源對斜臥青霉野生菌株和突變菌株纖維素酶和半纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄的影響:采用RT-qPCR技術(shù)對斜臥青霉114-2和JU-A10-S在不同碳源培養(yǎng)條件下的4個纖維素酶基因(ce17B、ce15A、ce17A、ce16A)和2個木聚糖酶基因(xyn10A、xyn11A)的轉(zhuǎn)錄情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在轉(zhuǎn)錄水平上是共調(diào)控的。微晶纖維素或者微晶纖維素與麥麩對菌株114-2和JU-A10-S中纖維素酶和半纖維素酶基因的表達都有

7、很強的誘導(dǎo)作用，且微晶纖維素與麥麩的誘導(dǎo)效果要強于微晶纖維素的誘導(dǎo)效果。乳糖對菌株114-2中纖維素酶和半纖維素酶基因表達有很強的誘導(dǎo)作用，但是對菌株JU-A10-S沒有表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)作用，可能與乳糖的轉(zhuǎn)運或者代謝途徑受到了破壞有關(guān)。山梨糖對菌株JU-A10-S中纖維素酶和半纖維素酶基因表達有很強的誘導(dǎo)作用，但是對菌株114-2沒有表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)作用，可能與山梨糖的代謝速率無關(guān)，而是由其它突變引起的。菌株JU-A10-S在葡萄糖培養(yǎng)

8、條件下，纖維素酶和半纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄水平要遠遠高于菌株114-2中各基因轉(zhuǎn)錄水平，表現(xiàn)出顯著的抗降解物阻遏。菌株JU-A10-S在所有培養(yǎng)條件下，纖維素酶和半纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄水平都要高于菌株114-2中各基因轉(zhuǎn)錄水平，可能與creA的移碼突變部分有關(guān)。
　　 3.利用雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)(2D-DIGE):研究了斜臥青霉胞外酶系組成，并對野生菌株與突變高產(chǎn)菌株在不同培養(yǎng)條件下的胞外差異蛋白進行了分析利用雙向熒光差異凝膠電泳技

9、術(shù)(2D-DIGE)對斜臥青霉野生菌株114-2與突變高產(chǎn)菌株JU-A10-T在葡萄糖、微晶纖維素.麥麩培養(yǎng)條件下的胞外蛋白進行了分析。成功鑒定出了38種蛋白，其中大部分蛋白為生物質(zhì)降解酶類，參與纖維素、半纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、果膠、幾丁質(zhì)等的降解。野生菌株114-2在葡萄糖培養(yǎng)條件下，鑒定到3種基礎(chǔ)性表達纖維素酶，并鑒定到含量較高的淀粉酶、果膠酶和蛋白酶PepA。野生菌株114-2在微晶纖維素-麥麩培養(yǎng)條件下，胞外纖維素酶和半纖維酶的

10、種類和含量都在增加，但并未檢測到果膠酶，顯示果膠酶與(半)纖維素酶的合成分別屬于不同的調(diào)控體系。此外，在胞外還檢測到了含量較高的蛋白酶PepB，而并沒有檢測到蛋白酶PepA，顯示這兩種蛋白酶的合成受培養(yǎng)條件的影響。突變菌株JU-A10-T在葡萄糖培養(yǎng)條件下，表現(xiàn)出明顯的抗降解物阻遏特性，胞外纖維素酶和半纖維素酶含量明顯上調(diào)，并出現(xiàn)更多種類的纖維素酶和半纖維素酶，但淀粉酶的合成受到了抑制。突變菌株JU-A10-T在微晶纖維素-麥麩培養(yǎng)條件

11、下，表現(xiàn)出明顯的超誘導(dǎo)，胞外蛋白濃度、纖維素酶活和木聚糖酶活大幅度提高；胞外蛋白中幾種纖維素酶和半纖維素酶組分含量明顯上調(diào)，而其它纖維素酶和半纖維素酶的含量則幾乎都下調(diào)，顯示木質(zhì)纖維素降解酶受到的調(diào)控之間存在部分差異；另外只檢測到痕量淀粉酶并且未檢測到蛋白酶，顯示突變株中相關(guān)調(diào)控系統(tǒng)發(fā)生了重要變異。
　　 4.敲除了斜臥青霉α-甘露糖苷酶基因和絲氨酸蛋白激酶基因，對其生物學(xué)功能進行了初步研究。利用融合PCR和巢式PCR方法構(gòu)建了

12、α-1，2-甘露糖苷酶基因(mnsl)和絲氨酸蛋白激酶基因(pkl)敲除盒，并利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，成功敲除了斜臥青霉KU-39 mnsl基因和pkl基因。α-1，2-甘露糖苷酶基因(mnsl)和絲氨酸蛋白激酶基因(pkl)的敲除對菌株的菌落大小、孢子顏色、孢子形態(tài)、菌絲直徑均沒有影響。α-1，2-甘露糖苷酶基因(mnsl)的敲除，提高了胞外蛋白濃度和纖維素酶活力，猜測其可能參與了未正確折疊蛋白的清除。絲氨酸蛋白激酶基因(pkl)的敲