嗜熱乙醇桿菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究.pdf

1、嗜熱厭氧乙醇桿菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)作為嗜熱菌中乙醇產(chǎn)量較高的菌種，它具有生長溫度高，較好的耐酸性等優(yōu)點以及完整的纖維素和半纖維素代謝系統(tǒng)，這些優(yōu)點使其成為乙醇生產(chǎn)菌改造的熱點。轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)因低背景干擾，反應(yīng)成分明確，結(jié)果清晰準(zhǔn)確成為研究菌體轉(zhuǎn)錄情況的有力工具。
　　 嗜熱乙醇桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系建立包括：①尋找能夠穩(wěn)定存在于嗜熱厭氧乙醇桿菌內(nèi)的革蘭氏陽性菌來源的復(fù)制子和構(gòu)建整合質(zhì)粒pTE—

2、I2；②探索嗜熱乙醇桿菌的電轉(zhuǎn)化方法和超聲轉(zhuǎn)化方法，并且嘗試通過轉(zhuǎn)化的方法觀察嗜熱乙醇桿菌乙醇產(chǎn)量的變化。
　　 用pHsh和熱穩(wěn)定性DNA連接酶構(gòu)建的定向進化系統(tǒng)，尋找能夠穩(wěn)定存在于嗜熱乙醇桿菌的革蘭氏陽性菌來源的復(fù)制子。以質(zhì)粒為模板，含有抗性基因的線性片段作為引物，熱穩(wěn)定性Tma DNA連接酶與Taq DNA聚合酶同時加入到PCR反應(yīng)體系中進行反應(yīng)。利用Taq DNA聚合酶在擴增過程中引入錯配堿基，TmaDNA連接酶將擴增產(chǎn)

3、物中的Nick進行連接，擴增出的目標(biāo)PCR產(chǎn)物為環(huán)狀的質(zhì)粒，該PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化嗜熱乙醇桿菌感受態(tài)細胞，并在與引物所帶的選擇標(biāo)記相應(yīng)的抗性培養(yǎng)基中，選擇性地培養(yǎng)含突變基因的轉(zhuǎn)化子。
　　 Teth11作為一個背景完全未知的蛋白，通過本實驗室之前的實驗已經(jīng)證實，Teth11能特異性結(jié)合在adhE基因上游啟動子區(qū)域，此蛋白在體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中扮演阻遏蛋白的角色抑制基因表達。我們采取生物信息學(xué)預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)，對其結(jié)構(gòu)進行研究，發(fā)現(xiàn)該蛋白一級