楊梅樹皮有效成分抗腫瘤活性的體外研究.pdf

1、楊梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc)是楊梅科楊梅屬水果，喜濕、耐陰寒，為我國主要果樹之一。楊梅樹皮中含有多酚、黃酮、二芳基庚烷、單寧、三萜等具有多種藥理活性的化合物。本文采用人肝癌細胞(HepG2)、人膀胱癌細胞(YTS-1)、小鼠黑色素瘤細胞(B16)、人前列腺癌細胞(PC-3)等典型的腫瘤細胞株進行體外培養(yǎng)，研究了楊梅樹皮提取物和其主要特征性成分(楊梅素、楊梅苷等)的抗癌活性，發(fā)現(xiàn)它們普遍具有良好的抑制腫瘤細胞

2、體外增殖的活性和誘導腫瘤細胞凋亡的作用，尤其是楊梅素與楊梅苷聯(lián)用在PC-3細胞上表現(xiàn)出極顯著的協(xié)同增效作用，確定了二者配合的最佳比例關(guān)系，并對其協(xié)同作用機制進行了研究。同時，在B16細胞的試驗研究中，楊梅苷表現(xiàn)出可與熊果苷媲美的美白潛力。主要研究結(jié)論如下：
　　 (1)楊梅樹皮醇提物經(jīng)由正丁醇萃取得到正丁醇分級相(BuE)和水分級相(WaE)，分別測定了兩相的多酚、總黃酮含量(W/％)。WaE中多酚和總黃酮含量分別為36.01%

3、±0.8148%、33.15%±0.7374%，BuE中的多酚和總黃酮含量分別為61.01%±0.1165%、31.20%±0.7987%。通過DPPH自由基清除實驗，結(jié)果表明WaE和BuE的半抑制濃度(IC50)分別為164.8μg/mL、114.8μg/mL。通過高效液相色譜法分析，鑒定BuE中主要成分為楊梅素、楊梅苷和槲皮素，并測得BuE中楊梅素、楊梅苷和槲皮素的含量(W/%)分別為3.75%±0.58%、29.28%±1.27%

4、、6.06%±0.355%，摩爾比為1:5.35:1.7。
　　 (2)對人肝癌細胞HepG2的體外抑制試驗發(fā)現(xiàn)，BuE具有較強的細胞增殖抑制作用。在楊梅素、楊梅苷、楊梅素+楊梅苷(1:1摩爾比)三組試樣中，楊梅苷的效果最弱。培養(yǎng)24h時，楊梅素、楊梅苷、楊梅素+楊梅苷對HepG2的細胞增殖的IC50分別為841.03μmol/L、1578.13μmol/L、652.79μmol/L；培養(yǎng)48h時，三者的IC50分別為321.6

5、7μmol/L、908.20μmol/L、286.92μmol/L，而同期BuE的IC50為116.54μg/mL；培養(yǎng)72h時，楊梅素與楊梅苷聯(lián)用的抑制效果略高于單獨使用楊梅素(濃度為300μmol/L時抑制率分別為52.88%、48.82%)，未表現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用，而此時BuE的IC50達到80.05μg/mL；表明楊梅樹皮有效成分對HepG2細胞的增殖抑制具有時間依賴關(guān)系。同時，通過AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測

6、，表明三組試樣能誘導HepG2細胞的凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；高濃度(300μmol/L)時，楊梅素、楊梅苷、楊梅素+楊梅苷的誘導細胞凋亡率分別為38.04%、13.77%、38.67%；楊梅素與楊梅苷聯(lián)用對細胞的早期誘導凋亡作用較強，單獨使用楊梅素則對細胞的晚期誘導凋亡作用較強。
　　 (3)對人膀胱癌細胞YTS-1的體外增殖抑制試驗表明，培養(yǎng)48h時，楊梅素、楊梅苷、楊梅素+楊梅苷的IC50分別為240.10μmol/L、2

7、72.05μmol/L、378.82μmol/L；培養(yǎng)72h時，IC50分別為198.95μmol/L、209.15μmol/L、251.06μmol/L，表明三組試樣對YTS-1細胞的增殖抑制作用均具有時間依賴性，楊梅素與楊梅苷聯(lián)用并未表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。同時，采用PI染色法對YTS-1進行細胞周期檢測，發(fā)現(xiàn)高濃度(300μmol/L)時，三組試樣對YTS-1細胞的G2/M期具有顯著的阻滯作用(P<0.01)。另外，在誘導YTS-1細

8、胞凋亡的試驗中發(fā)現(xiàn)，低濃度(37.5μmol/L)時三組樣品對YTS-1細胞的誘導凋亡作用不強，而高濃度(300μmol/L)時，作用極顯著(P<0.01)，楊梅素、楊梅苷、楊梅素+楊梅苷對YTS-1的誘導細胞凋亡率分別達31.70%、25.50%、25.19%；且楊梅素的早期誘導凋亡作用較強，楊梅素與楊梅苷聯(lián)用的晚期誘導凋亡作用較強。
　　 (4)以公認的天然美白物質(zhì)熊果苷為陽性對照，對小鼠黑色素瘤細胞(B16)進行細胞增殖抑

9、制試驗。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48h時，楊梅素、楊梅苷、熊果苷對B16細胞的IC50分別為131.55μmol/L、138.44μmol/L、154.03μmol/L；培養(yǎng)72h時IC50分別達90.4μmol/L、88.6μmol/L、101.55μmol/L，表現(xiàn)出時間依賴性。同時，通過對B16細胞內(nèi)酪氨酸酶活性的檢測發(fā)現(xiàn)，楊梅苷對胞內(nèi)酪氨酸酶活性的抑制率高達(74.52±3.248)%；對B16細胞內(nèi)黑色素含量的檢測發(fā)現(xiàn)，楊梅苷抑制黑色素合成的

10、作用顯著；表明楊梅苷的美白效果可與熊果苷媲美。
　　 (5)對人前列腺癌細胞PC-3的細胞增殖抑制試驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)48h時，楊梅素、楊梅苷和槲皮素對PC-3細胞增殖的IC50分別為94.48μmol/L、267.1μmol/L、418.25μmol/L，BuE和WaE的IC50則為95.21μg/mL和118.3μg/mL；在研究楊梅素與楊梅苷協(xié)同作用試驗中，培養(yǎng)48h時，試樣濃度75μmol/L的楊梅素、楊梅苷、楊梅素+楊梅苷(

11、各自為37.5μmol/L)對PC-3細胞株的增殖抑制率分別為40.53%、13.34%、72.28%，楊梅素和楊梅苷之間具有協(xié)同增效作用。采用吖啶橙染色法分析，不同給藥濃度的PC-3細胞呈現(xiàn)凋亡樣變化，并表現(xiàn)出時間與劑量的依賴關(guān)系。通過Annexin V-FITC/PI雙染法檢測，確認楊梅素和楊梅苷能夠誘導PC-3細胞凋亡，且楊梅素的作用更強；楊梅素誘導PC-3細胞晚期凋亡的作用較強，而楊梅苷誘導細胞早期凋亡的作用較強；同時，二者表現(xiàn)

12、出顯著的協(xié)同增效作用。
　　 (6)對楊梅素與楊梅苷在PC-3細胞體外增殖抑制試驗中的協(xié)同增效作用進行進一步研究，發(fā)現(xiàn)楊梅素與楊梅苷對PC-3細胞株的增殖抑制存在時間和劑量依賴關(guān)系，培養(yǎng)72h時，楊梅素與楊梅苷聯(lián)用的作用最強，最佳摩爾濃度比為1：5。通過PI染色法檢測PC-3細胞周期，發(fā)現(xiàn)楊梅素、楊梅苷都能將PC-3細胞周期阻滯于G0/G1期，且楊梅素與楊梅苷聯(lián)用對PC-3細胞周期的影響最強，二者的最佳摩爾濃度比為1:5。對PC

13、-3細胞凋亡作用的研究還表明，低濃度時(75μmol/L)楊梅素、楊梅苷的細胞誘導凋亡作用都不強，而在摩爾比為1:5和1：7時誘導細胞凋亡的作用顯著(細胞凋亡比例分別為32.00%、33.30%)。和單獨使用楊梅苷時的早期誘導凋亡作用較強相比，摩爾比1:7時雖然楊梅苷的比例增加，其晚期凋亡作用卻較強，因此可以推斷楊梅素與楊梅苷聯(lián)用時對PC-3細胞的誘導凋亡作用機制被改變。同時，通過TUNEL法進一步分析細胞晚期凋亡，表明楊梅素與楊梅苷之

14、間具有顯著的協(xié)同增效作用，二者摩爾比濃度為1:5和1:7時誘導PC-3細胞晚期凋亡的作用較強。
　　 綜上所述，楊梅樹皮提取物及其特性成分楊梅素和楊梅苷對所試的多種腫瘤細胞株的體外增殖均表明出顯著的抑制活性及選擇性；尤其是在對PC-3細胞的增殖抑制試驗中，楊梅素和楊梅苷表現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用，且二者復(fù)配的最佳濃度范圍與其在楊梅樹皮醇提物正丁醇分級相(BuE)中存在的比例關(guān)系相吻合，從另一側(cè)面印證了楊梅樹皮醇提物正丁醇分級相(B