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文檔簡介
1、目的:蜈蚣三七(曾用名地烏)系毛莨科銀蓮花屬植物林蔭銀蓮花的干燥根莖,其性溫,味辛微苦具有祛風濕、強筋骨、消腫止痛之功效,善治風濕疼痛、跌打損傷。湖北中醫(yī)學院中藥研究所由蜈蚣三七中得到蜈蚣三七提取物,制成地烏風濕安膠囊,用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA),與2004年9月2日獲國家五類中藥新藥的臨床研究批件,現(xiàn)處于3期臨床實驗階段。地烏風濕安膠囊通過實驗投入生產(chǎn)后,可預(yù)見其原料臨床需求量會不斷增加。由于蜈蚣三七原植物林蔭銀蓮花生長周期長、分
2、布海拔高、人工栽培較困難,通過化學合成其藥用活性成分蜈蚣三七皂苷W3是解決林蔭銀蓮花植物資源匱乏的重要策略之一。人工合成方法與從植物中分離蜈蚣三七皂苷W3相比,具有不受資源限制、方法簡便、成本低、耗時短、適宜于規(guī)?;a(chǎn)的優(yōu)勢。
大量實驗研究證明,毛茛科銀蓮花屬植物有較好的抗腫瘤活性,本課題將用合成的蜈蚣三七皂苷W3、蜈蚣三七皂苷、齊墩果酸三種藥物,分別作用于人肝癌Hep3B細胞、Hel人胚肺細胞,進行體外抗腫瘤研究,探討
3、中藥成分或單體的作用機理,驗證合成的W3與蜈蚣三七皂苷具有相似甚至更好的活性,為進一步研究蜈蚣三七成分的藥理學毒性及開發(fā)新藥提供實驗基礎(chǔ)。
方法:
一.蜈蚣三七有效成分W3的半合成
利用葡萄糖(C6H12O6)、L-鼠李糖(C6H12O5)、D-木糖(C5H10O5)、齊墩果酸(C30H48O3)等單糖制得化合物1(2,3-二-0-乙?;?4,6-0-芐叉-β-D-葡萄糖乙硫苷),化合物6(2,
4、3,4,6-四-0-乙?;?β-D-葡萄糖對甲氧基苯酚氧苷),化合物4(2,3,4-三-0-苯甲?;?α-L-鼠李吡喃糖三氯乙酰亞胺酯),化合物11(3,4-二-0-乙?;?1,2-0-原甲酸酯-α-D-吡喃木糖),化合物17(齊墩果酸三苯基甲基酯)。再以化合物1、4、6、11和17為原料,采用匯聚式路線,完成W3的半合成。
二.合成的W3抗腫瘤作用實驗
1.藥物分組:本實驗分為6個組,分別為蜈蚣三七總苷、合
5、成的W3以及齊墩果酸,同時設(shè)立陽性藥物對照組(順鉑)、DMSO(二甲基亞砜)組、空白對照組(未加藥組)。
2.采用噻唑藍(MTT)還原法測定各實驗組對Hep3B細胞、Hel細胞的生長抑制率。
3.倒置顯微鏡觀察各組藥物作用于Hep3B細胞、Hel細胞48h后的形態(tài)學變化。
4.透射電鏡進行細胞超微結(jié)構(gòu)觀察。
5.流式細胞儀檢測各組藥物作用后Hep3B細胞細胞周期分布和凋亡率。
6、> 6.統(tǒng)計學分析。采用統(tǒng)計軟件SPSS15.0分析,用獨立樣本的t檢驗,X2檢驗對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行分析,如有差異,多組間參數(shù)兩兩比較采用q檢驗。以a=0.05為檢驗水準。(1)Y軸為細胞存活率,X軸為藥物濃度,制作細胞生長曲線。(2)利用公式計算細胞48小時細胞增殖抑制率。(3)通過EXCEL畫圖法做趨勢線來求48小時IC50值。
結(jié)果:
一.蜈蚣三七有效成分W3的半合成
完成蜈蚣三七有效成
7、分W3的合成,純度達到90%。
二.合成的W3抗腫瘤作用實驗
1.不同濃度不同藥物分組的藥物作用于體外培養(yǎng)的Hep3B細胞、Hel細胞48h后,各實驗組生長抑制率結(jié)果如下:
1.1 Hep3B細胞:合成的W3、蜈蚣三七總苷、齊墩果酸均對Hep3B細胞有增殖抑制作用。
1.2 Hel細胞:W3、蜈蚣三七總苷均對Hel細胞無明顯的細胞抑制作用。
2.藥物作用后,Hep3B
8、細胞的形態(tài)學變化倒置顯微鏡下觀察到:
2.1空白對照組:Hep3B細胞貼壁生長,彌散蔓延分布,呈紡錘形或多角形,細胞透亮,生長狀態(tài)良好。
2.2DMSO組:DMSO作用于Hep3B細胞與空白對照組比較生長情況無明顯的差異。
2.3W3組:細胞數(shù)量顯著減少,細胞相互分離,透亮度差,貼壁大量減少,細胞體積明顯縮小,變圓,可見大量細胞崩解碎片,細胞核縮小或崩解消失,核染色質(zhì)邊聚,可見裸露的核。以中劑量
9、組效果最好。
2.4蜈蚣三七總苷組:細胞數(shù)量減少,體積變小,收縮變圓,可見裸露的核,細胞腫脹,形成空泡。以高劑量組效果較好。
2.5齊墩果酸組:細胞數(shù)量減少,體積變小,收縮變圓。效果略遜于蜈蚣三七總苷。
2.6順鉑組:細胞數(shù)量明顯減少,細胞破壞形成碎片,細胞溶解,可見裸露的細胞核。
3.電鏡進行細胞超微結(jié)構(gòu)觀察
3.1空白對照組:可見Hep3B細胞包膜完整,細胞質(zhì)中細
10、胞器分布均勻,線粒體大小均勻,細胞核清晰,核膜完整。
3.2 W3組:細胞核濃縮,細胞核擠向一邊,染色質(zhì)深染,聚集成團,胞漿濃縮,細胞質(zhì)萎縮,細胞器腫脹變形,擁擠,細胞膜破裂,絨毛消失,細胞肌漿網(wǎng)明顯擴張呈巨大空泡狀,線粒體退行性變,腫脹、結(jié)構(gòu)破壞,嵴紊亂、稀疏。
3.3蜈蚣三七總苷組:可見細胞核收縮,核質(zhì)濃縮邊聚。細胞病變明顯輕于W3組。
4.流式細胞儀檢測Hep3B細胞的凋亡率。體外培養(yǎng)的H
11、ep3B細胞經(jīng)W3藥物高劑量作用后細胞碎片及早期凋亡細胞較空白對照組高。經(jīng)W3藥物中劑量作用后可見大量的細胞碎片及早期凋亡細胞,晚期凋亡細胞或者壞死細胞也高于空白對照組。經(jīng)W3藥物低劑量作用后可見大量的細胞碎片。經(jīng)蜈蚣三七總苷中劑量作用后出現(xiàn)了晚期凋亡細胞及壞死細胞及早期凋亡細胞,晚期凋亡細胞或者壞死細胞百分率明顯高于空白對照組,經(jīng)齊墩果酸高劑量作用后可見大量的細胞碎片。
結(jié)論:
1.本課題所采用的W3半合成
12、路線有效可行。
2.W3、蜈蚣三七總苷、齊墩果酸均對Hep3B細胞的有增殖抑制作用。對Hel細胞無明顯的細胞抑制作用。
3.形態(tài)學變化(光鏡、電鏡):W3中劑量的Hep3B細胞毒效果最好,蜈蚣三七總苷次之,母核齊墩果酸再次之。
4.經(jīng)流式細胞儀檢測Hep3B細胞的凋亡率,結(jié)果說明W3其作用機制可能主要與殺傷Hep3B細胞及誘導細胞凋亡有關(guān)。蜈蚣三七總苷其作用機制可能主要與誘導細胞凋亡有關(guān)。母核齊
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