食烷菌和煙曲霉酯酶的酶學(xué)性質(zhì)及定點(diǎn)突變研究.pdf

1、酯酶，即羧酸酯酶(carboxylesterases，EC3.1.1.1)，普遍存在于微生物、植物以及動(dòng)物中。從廣義上來(lái)說(shuō)，酯酶是催化酯水解的酶的總稱;狹義上來(lái)說(shuō)，酯酶則是催化短鏈脂肪酸酯降解的一類脂肪酶，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥、洗滌劑、生物柴油的合成等方面具有廣泛的應(yīng)用。
　　本研究以食烷菌總DNA為模板，克隆獲得一酯酶基因estB。序列比對(duì)結(jié)果顯示，EstB具有很低的同源性，最高僅有45％，因此可判定其為一種新型的酯酶。此外，Est

2、B包含有存在于大多數(shù)酯酶及脂肪酶結(jié)構(gòu)中的催化三聯(lián)體Ser211-Trp353-Gln385和保守五肽Gly209-X-Ser211-X-Gly213。在酶學(xué)性質(zhì)方面，EstB的最適溫度為20℃，最適pH為8.5，動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km，kcat以及kcat/Km分別是0.15mM，0.54×103s-1and3.6×103s-1mM-1。與近年來(lái)已報(bào)道的酯酶相比，EstB不僅表現(xiàn)出極其罕見(jiàn)的冷活性:在0-20℃溫度范圍內(nèi)活性幾乎保持不變，0℃下

3、依然具有97％左右活性;而且具有良好的耐有機(jī)溶劑能力:在濃度高達(dá)70％的有機(jī)溶劑中保溫30min后，仍然剩余70％-110％左右的活性。EstB所表現(xiàn)出的冷活性以及耐有機(jī)溶劑能力使其在需要極端條件下進(jìn)行的工業(yè)過(guò)程中具有廣泛被應(yīng)用的潛力。
　　以煙曲霉為目標(biāo)菌株，得到一酯酶蛋白EstQ。EstQ的最適溫度為40℃，最適pH為9.0。為了提高酶的熱穩(wěn)定性，以理性設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了三個(gè)突變體，分別為A134T，V160T

4、和A134T/V160T，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示，A134T和V160T與WT具有相似的溫度變化曲線，最適溫度均為40℃，A134T/V160T的最適溫度則提高至45℃。突變體與WT均具有相似白勺最適pH和pH穩(wěn)定性曲線。與WT相比，突變體的熱穩(wěn)定性均有不同程度的提高:在45℃保溫30min后，剩余50％-76％的活性，與WT相比，提高20-40％左右。WT，A134T及V160T在50℃的T1/2分別為5min，10mi

5、n及15min。突變體A134T/V160T的T1/2則超過(guò)了實(shí)驗(yàn)時(shí)間120min，與WT相比，提高了24倍左右。然而氨基酸的替換卻導(dǎo)致EstQ對(duì)底物pNPC4的親和力(1/Km)以及催化效率(kcat/Km)的降低。為了探究突變位點(diǎn)對(duì)酶熱穩(wěn)定性影響的機(jī)理，本研究對(duì)WT以及A134T/V160T的同源結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬。根據(jù)模擬結(jié)果可推斷出，EstQ熱穩(wěn)定性的提高可能是由于突變位點(diǎn)的疏水性氨基酸(Ala134，Val160)被親水性氨基酸T