兩種新型嗜熱酯酶的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、酯酶是一類(lèi)水解含羧基酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性與外源性化合物的多功能酶,屬于絲氨酸水解酶家族。來(lái)源于微生物的酯酶能夠高效催化酯化、轉(zhuǎn)酯、酯交換以及光學(xué)活性物質(zhì)的動(dòng)力學(xué)拆分等反應(yīng),廣泛應(yīng)用于石油開(kāi)采、工業(yè)廢水處理、食品生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥化工等多種領(lǐng)域。嗜熱酯酶指高溫下(最適反應(yīng)溫度≥60℃)催化酯鍵水解、合成和交換反應(yīng)的水解酶類(lèi),與中溫酯酶相比,嗜熱酯酶在熱穩(wěn)定性、對(duì)變性劑和有機(jī)溶劑抗性以及催化速率等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),是近年來(lái)生物催

2、化領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。
　　本文克隆、表達(dá)和純化了源于嗜熱菌海棲熱袍菌和硫化葉菌的新型酯酶EST10(Tm1160)和EstSt7(ST2026)。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增酯酶基因Tm1160和ST2026,克隆到載體pET15b中,構(gòu)建重組載體pET15b-Tm1160和pET15b-ST2026;將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。經(jīng)熱處理、鎳柱親和層析和分子篩層析純化,得到純化的重組酯酶蛋白。SDS

3、-PAGE結(jié)果顯示,純化的酯酶EST10和EstSt7蛋白分子量分別為37.2KDa和39.4KDa。
　　分別對(duì)酯酶EST10(Tm1160)和EstSt7(ST2026)的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)研究。分子篩和化學(xué)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)表明,酯酶EST10在水溶液中以二聚體形式存在。該酶最適反應(yīng)溫度和pH分別為70℃和5.0-5.5;通過(guò)水解底物特異性和動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)酯酶EST10能夠水解短鏈脂肪酸(≤C10)形成的對(duì)硝基苯酚酯,最適底物為對(duì)硝

4、基苯基丁酸酯。酯酶EST10具有較強(qiáng)熱穩(wěn)定性和耐酸性,90℃半衰期為60min;在70℃和pH4.5環(huán)境下處理60min后,仍然保持約50％的活性。此外,該酶對(duì)有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、丙酮、異丙醇、異戊醇、氯仿等)、表面活性劑(吐溫20、吐溫80、Triton-X100)和變性劑(SDS、DTT、尿素)等有較好的抗性。金屬離子Co2+、Cu2+和Fe2+對(duì)該酶活性有微弱的抑制作用。酯酶EST10能夠?qū)ν宸乙阴ミM(jìn)行高效選擇性

5、拆分,生成(S)-酮洛芬,具有一定的手性藥物生產(chǎn)應(yīng)用前景。
　　通過(guò)分析酯酶EstSt7(ST2026)的氨基酸序列、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和保守結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)EstSt7及其同源蛋白不屬于已經(jīng)報(bào)道的細(xì)菌酯酶/脂肪酶八大家族,而是形成一個(gè)新家族。酯酶EstSt7最適反應(yīng)溫度為80℃,90℃條件下半衰期可達(dá)180min;最適反應(yīng)pH為9.0,在pH8.0-10.0范圍內(nèi)酶活保持80%以上,屬于堿性酯酶。底物特異性和動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明該酶最適底物為硝基