海棲熱袍菌葡萄糖異構(gòu)酶基因xylA的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì).pdf

1、海棲熱袍菌Thermotogamaritima是嗜極端高溫的厭氧細(xì)菌，其產(chǎn)生的葡萄糖異構(gòu)酶由于其出色的耐熱性有著潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。由于T.maritima苛刻的培養(yǎng)條件導(dǎo)致其葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)量較低。通過PCR方法克隆T.maritimaMSB8編碼葡萄糖異構(gòu)酶基因xylA至大腸桿菌Escherichiacoli熱激表達(dá)質(zhì)粒pHsh，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHsh-xylAl。通過mRNA二級結(jié)構(gòu)在線分析軟件MFOLD對重組質(zhì)粒pHsh-xylAl

2、中翻譯起始位點(diǎn)AUG附近mRNA二級結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象與mRNA二級結(jié)構(gòu)自由能進(jìn)行分析，在不改變目的基因翻譯的氨基酸序列的前提下，利用同義突變和改變AUG前某些堿基序列的方法，達(dá)到打破mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)及翻譯起始位點(diǎn)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，提高mRNA自由能的目的，構(gòu)建優(yōu)化后表達(dá)質(zhì)粒pHsh-xylA2。電擊轉(zhuǎn)化E.coliJM109，誘導(dǎo)表達(dá)，分析酶活，E.coliJM109(pHsh-xylA2)酶活為3.6U/mL發(fā)酵液，比酶活為4.95U

3、/mg粗蛋白，是優(yōu)化前的3.8倍。 通過熱處理和離子交換層析純化兩步得到電泳純的酶制品，純化倍數(shù)和回收率分別為8.02和49.02。對酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該重組酶為金屬離子激活性酶，Mg2+，Co2+對相對酶活有很強(qiáng)的激活作用，其最適pH為7.0，最適反應(yīng)溫度為95℃，且在pH6～8之間有著較好的穩(wěn)定性，在95℃下半衰期長達(dá)5h以上。以葡萄糖為底物時(shí)的表觀Km和Vmax分別為105mmol/L和45.2U/mg。 通過在搖

4、瓶條件的優(yōu)化，得到經(jīng)濟(jì)適用、適合重組菌E.coliJM109(pHsh-xylA2)發(fā)酵的合成培養(yǎng)基配方：葡萄糖10g/L，(NH4)2SO46g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO410g/L,MgSo4·7H2o3g/L，檸檬酸3g/L，TES1mL/L，pH7.0。在3.7L臺式發(fā)酵罐中，在控制溶氧30％以上，在重組菌的對數(shù)生長中期開始流加碳氮源，在對數(shù)生長后期升溫誘導(dǎo)8h，最終菌體光密度達(dá)到44.8，重組菌發(fā)酵液酶活為15.6U/m