右旋糖酐酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、本論文自土壤中分離篩選得到了兩株右旋糖酐酶產(chǎn)生菌，對兩菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的和分子手段鑒定，并研究了該右旋糖酐酶粗酶性質(zhì)和菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件。研究內(nèi)容如下：
　　 右旋糖酐酶產(chǎn)生菌株的篩選：采用以右旋糖酐作唯一碳源的篩選培養(yǎng)基，經(jīng)過多次篩選和單孢子分離法獲得產(chǎn)右旋糖酐酶的單一菌株；通過小室培養(yǎng)法對各菌絲形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)合菌落形態(tài)和液態(tài)培養(yǎng)形態(tài)對各菌株進(jìn)行初步鑒別；采用藍(lán)色葡聚糖培養(yǎng)基鑒定各菌株的產(chǎn)酶特性；用DNS測還原糖法計算各菌株發(fā)

2、酵液酶活。結(jié)果如下：分離篩選獲得5株產(chǎn)酶菌株，分別編號D1～D5，形態(tài)學(xué)初步判斷認(rèn)為D1和D5為青霉菌，D2和D3為鐮刀霉菌，D4為頭孢霉菌。D4和D5菌在藍(lán)色葡聚糖平板上有明顯透明圈，酶活測定結(jié)果同樣顯示這兩種菌產(chǎn)酶最高，因此選擇D4和D5菌進(jìn)行下一步研究。
　　 右旋糖酐酶產(chǎn)生菌的分類鑒定：分別對D4和D5菌進(jìn)行分生孢子、分生孢子梗、菌落形態(tài)，色素顏色等形態(tài)學(xué)研究，并對菌株的ITS rDNA序列進(jìn)行克隆測序，與GenBank

3、中已知菌的ITS rDNA比對，用Neighbor-j oining方法構(gòu)建聚類分析樹狀圖，并用Bootstrap法對其評估。鑒定結(jié)果如下：D4菌的ITS rDNA序列與Verticillium nigrescens有99％的同源性，然而該分子鑒定結(jié)果不與其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相符，根據(jù)更為準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)特征鑒定為頭孢霉屬。D5菌通過形態(tài)學(xué)分析其為黃綠青霉(Penicillium citreoviride)，其ITS序列的分子鑒定支持了基于形態(tài)

4、特征的鑒定結(jié)果，該菌株的ITS與Penicillium daleae，Penicilliumjanthinellum菌株的ITS rDNA序列同源性最高，分別達(dá)到97％和98％。
　　 右旋糖酐酶酶學(xué)性質(zhì)研究：采用薄層層析法分析右旋糖酐酶降解右旋糖酐、普魯藍(lán)糖、淀粉和羧甲基纖維素的酶促產(chǎn)物；通過DNS測還原糖法測酶活，研究酶的最適作用溫度、熱穩(wěn)定性、最適作用pH、pH穩(wěn)定性，以及金屬離子、離子強(qiáng)度對酶活的影響。結(jié)果如下：來自D4

5、、D5的右旋糖酐酶均只能降解連續(xù)的α-1，6糖苷鍵產(chǎn)生異麥芽三糖，對其他糖苷鍵無作用，證明該酶為外切型異麥芽三糖水解酶。該酶具有獨(dú)特的底物特異性和產(chǎn)物均一性，在理論及應(yīng)用上具有一定意義。D4所產(chǎn)的右旋糖酐酶最適作用溫度為40℃，在40℃半衰期為80min，最適作用pH為7，在pH5.6～pH7范圍內(nèi)穩(wěn)定，低濃度的Ba2+和Mg2+可促進(jìn)酶活，150～300mmol/L NaCl所產(chǎn)生的離子強(qiáng)度促進(jìn)酶活。D5所產(chǎn)的右旋糖酐酶最適作用溫度為

6、55℃，在50℃半衰期為3 h，最適作用pH為6.5，在pH4.0～pH6.5范圍內(nèi)穩(wěn)定；金屬離子K+、Ba2+顯著促進(jìn)酶活，Ca2+、Fe2+強(qiáng)烈抑制酶活；150mmol/LNaCl所產(chǎn)生的離子強(qiáng)度促進(jìn)酶活。
　　 產(chǎn)酶發(fā)酵研究：通過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對兩菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如下：D4的最優(yōu)發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基中蔗糖、葡聚糖、酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1％、1％、0.2％，pH5.0，接種量1.5 mL，裝液量80mL

7、/250mL，轉(zhuǎn)速120r/min。25℃培養(yǎng)lld酶活達(dá)到138.11U/mL。D5的最優(yōu)發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基中淀粉、葡聚糖、氯化銨、酵母膏的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1％、1％、0.1％、0.1％，pH6.0，接種量1％，裝液量50mL/250mL，轉(zhuǎn)速120r/min。25。C培養(yǎng)13 d酶活達(dá)到176.80U/mL。
　　 D5菌所產(chǎn)右旋糖酐酶的分離純化研究：對發(fā)酵13d所得的發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，硫酸銨沉淀，DEAE-Sepharos