1、特異性結(jié)合DON抗原-抗體免疫復(fù)合物納米抗體的淘選、鑒定及表達(dá)2、基于噬菌體展示納米抗體的定量免疫PCR檢測(cè)Bt蛋白Cry1Ac方法的建立.pdf

1、本文分為二部分：
　　第一部分：
　　相對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)型免疫分析體系，非競(jìng)爭(zhēng)型免疫分析方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高以及檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。然而，對(duì)于小分子物質(zhì)而言，由于小分子物質(zhì)的分子量及結(jié)合表位較小，難以直接被兩個(gè)常規(guī)抗體同時(shí)結(jié)合，因此目前小分子物質(zhì)的免疫分析體系大多以競(jìng)爭(zhēng)型為主。本研究以食品中常見的真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）為小分子物質(zhì)的研究模型，在形成DON抗原-抗體免疫復(fù)合物的基礎(chǔ)上，投

2、入天然噬菌體展示納米抗體庫(kù)，親和淘選可特異性結(jié)合DON抗原-抗體復(fù)合物的噬菌體展示納米抗體，經(jīng)Phage-ELISA驗(yàn)證后，開展納米抗體的可溶性原核表達(dá)，為建立基于納米抗體的DON非競(jìng)爭(zhēng)型免疫分析體系提供了一種新的途徑和有效探索。本研究取得的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1．可特異性結(jié)合DON抗原-抗體免疫復(fù)合物納米抗體的親和淘選及鑒定
　　以DON為研究對(duì)象，DON抗原-抗體免疫復(fù)合物作為靶標(biāo)，經(jīng)過四輪親和淘選，從駝源天然噬菌體

3、展示納米抗體庫(kù)中首次獲得4種可特異性結(jié)合DON抗原-抗體免疫復(fù)合物的納米抗體，經(jīng)DNA測(cè)序分析后，分別命名為P-1、P-19、P-26、P-46，Phage-ELISA結(jié)果顯示，上述納米抗體對(duì)DON抗原-抗體復(fù)合物具有良好的結(jié)合特異性；建立了基于噬菌體展示納米抗體（P-26）的非競(jìng)爭(zhēng)型免疫分析DON曲線，結(jié)果顯示:當(dāng)DON標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在0～500 ng/mL區(qū)間時(shí)，投入了所獲噬菌體展示納米抗體的對(duì)應(yīng)板孔，其OD值隨著加入的DON濃度增加

4、而相應(yīng)地提高，表明所獲得的噬菌體展示納米抗體對(duì)DON抗原-抗體復(fù)合物具有較好的結(jié)合響應(yīng)度，但未呈現(xiàn)典型的線性曲線。
　　2.可特異性結(jié)合DON抗原-抗體免疫復(fù)合物納米抗體的原核表達(dá)
　　通過分子克隆技術(shù)，提取P-1、P-19、P-26、P-46的VHH編碼基因，將編碼基因克隆至pET25b（+）原核表達(dá)載體上，經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET25b-VHH-P-1、pET25b-VHH-P-19、pET25b-

5、VHH-P-26和pET25b-VHH-P-46，并轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta細(xì)胞；在1％葡萄糖，0.05 mM IPTG下誘導(dǎo)表達(dá)8 h，經(jīng)鎳柱純化，并用50 Mm咪唑洗脫后，獲得4種可溶性的納米抗體N-1、N-19、N-26、N-46。建立了基于可溶性納米抗體（N-26）的DON非競(jìng)爭(zhēng)型免疫分析反應(yīng)曲線，當(dāng)DON標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在8～100 ng/mL區(qū)間時(shí)，投入了納米抗體的對(duì)應(yīng)板孔，其OD值隨著加入的DON濃度增加而相應(yīng)地提高

6、，表明所獲得的可溶性納米抗體對(duì)DON抗原-抗體復(fù)合物具有較好的結(jié)合響應(yīng)度，為下一步開展DON的非競(jìng)爭(zhēng)型免疫分析體系的建立提供了重要研究材料及有效地探索。
　　第二部分：
　　Cry1Ac是一種常見的Bt（Bacillus thuringiensis,Bt）蛋白，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于抗蟲轉(zhuǎn)基因作物，比如大豆、棉花、水稻、小麥等。隨著眾多轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的逐漸商業(yè)化，市場(chǎng)上的轉(zhuǎn)基因食品日益增多，同時(shí)轉(zhuǎn)基因食品的安全性也逐漸受到大眾的關(guān)注及

7、重視，因此對(duì)食品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)就顯得十分重要。目前轉(zhuǎn)基因成分（Genetically modified ingredients，GMO）的檢測(cè)主要包括基于蛋白質(zhì)檢測(cè)的免疫分析以及基于核酸檢測(cè)的PCR（Polymerase chain reaction，PCR）分析兩大類。免疫分析具有特異性高、操作簡(jiǎn)單以及可高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)，然而由于其自身信號(hào)擴(kuò)增體系的局限性，也存在著靈敏度不高、假陽(yáng)性較多等缺陷。本研究在獲得可特異性結(jié)合Cry1

8、Ac蛋白的噬菌體展示納米抗體的基礎(chǔ)上，將免疫分析與核酸分析的技術(shù)優(yōu)勢(shì)進(jìn)行綜合，建立基于噬菌體DNA信號(hào)擴(kuò)增體系的免疫PCR分析Cry1Ac蛋白方式，主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.針對(duì)抗Cry1Ac噬菌體展示納米抗體編碼基因的CDR3區(qū)設(shè)計(jì)了特異性的PCR擴(kuò)增引物，成功地?cái)U(kuò)增了納米抗體的CDR3區(qū)（98 bp），為噬菌體展示納米抗體的特異性信號(hào)擴(kuò)增奠定了基礎(chǔ)。
　　2.將抗Cry1Ac單克隆抗體（8A8)作為捕獲抗體，抗Cry1

9、Ac噬菌體展示納米抗體（P-72）作為檢測(cè)抗體，建立了轉(zhuǎn)基因蛋白Bt-Cry1Ac的免疫PCR檢測(cè)方法。該方法的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示，其線性相關(guān)系數(shù)為0.9968，線性范圍為0.001～100 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.094 pg/mL；該方法對(duì)于Cry1Ac的同源蛋白Cry1Ab的交叉反應(yīng)率為3.4%，對(duì)其它雜類蛋白質(zhì)無(wú)交叉反應(yīng)，具備良好的檢測(cè)特異性；加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法用于檢測(cè)Bt-Cry1Ac的加標(biāo)回收率為78.81～