展青霉素特異性抗體的制備及其免疫學(xué)檢測方法的研究.pdf

1、展青霉素(Patulin，PAT)是由某些真菌產(chǎn)生的一種有毒次級代謝產(chǎn)物，在多種食品中均有發(fā)現(xiàn)，蘋果及其制品中尤為嚴重，具有急性和亞急性毒性、免疫毒性、致畸、致突變，致癌等作用。為了保證食品安全和質(zhì)量，建立快速而靈敏的PAT檢測方法一直備受關(guān)注。目前檢測展青霉素的方法主要是薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)等物理分析檢測方法，雖然它們可以精確地進行定性和定量分析，但其設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜?；诳乖贵w高特

2、異性反應(yīng)的免疫學(xué)檢測方法具有價廉、高效、靈敏、高通量等優(yōu)點，特別適合于大批量樣品的檢測，成為真菌毒素檢測方法的研究熱點。但目前很少有對展青霉素免疫學(xué)檢測方法的報道，這主要是由于展青霉素易與血液蛋白中的巰基和氨基反應(yīng)，不能在體內(nèi)穩(wěn)定存在，不能產(chǎn)生或產(chǎn)生很低效價的抗體。
　　 本實驗以L-阿拉伯糖為前體，經(jīng)過五步化學(xué)合成反應(yīng)，合成了較為穩(wěn)定的展青霉素結(jié)構(gòu)類似物，命名為P2，并通過核磁共振氫譜分析對該結(jié)構(gòu)進行了鑒定；然后通過活潑酯法，

3、將該半抗原與卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)相偶聯(lián)，分別制成了包被原P2-OVA和免疫原P2-BSA。根據(jù)展青霉素在體外較為穩(wěn)定的特點，首先對展青霉素進行修飾，然后連接到載體蛋白OVA，制成了另外一種檢測用的包被原P1-OVA；為建立直接ELISA的方法，將展青霉素修飾后與辣根過氧化酶連接，制成了酶標半抗原P1-HRP。
　　 將制備好的免疫原P2-BSA按照常規(guī)步驟分別免疫新西蘭大白兔和BABL/C小鼠，免疫結(jié)束后測定

4、抗血清效價。兔多克隆抗體通過取血、離心取血清并用ProteinG親和純化柱純化獲得；小鼠單克隆抗體通過取小鼠脾臟，與骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞，并進行單克隆化而得到產(chǎn)單一抗體的細胞系。純化后的多克隆抗體對P1-OVA的效價為1:6400,對P2-OVA的效價為1:12800；特異性單克隆抗體，經(jīng)proteinG親和層析柱純化后，抗體對P1-OVA的效價為1:3200,對P2-OVA的效價能夠達到1:6400。
　　 以制備的特