青霉素類(lèi)藥物殘留ELISA檢測(cè)方法研究.pdf

1、青霉素類(lèi)藥物是一類(lèi)重要的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，因其高效、低毒是目前獸醫(yī)學(xué)臨床上應(yīng)用最受青睞的藥物之一。由于該類(lèi)藥物的廣泛使用，使其在動(dòng)物源性食品上的殘留現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，雖然青霉素類(lèi)藥物本身對(duì)機(jī)體沒(méi)有很強(qiáng)毒性，但容易引起藥物過(guò)敏反應(yīng)，是各類(lèi)過(guò)敏藥物之最；同時(shí)，若長(zhǎng)期食用低濃度該類(lèi)抗生素，會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，菌群失調(diào)，導(dǎo)致人體免疫力降低；此外，還給動(dòng)物源性食品生產(chǎn)加工帶來(lái)不可估計(jì)的損失。因此，建立針對(duì)青霉素類(lèi)藥物殘留的快檢測(cè)方法，開(kāi)發(fā)價(jià)格適中

2、的試劑盒產(chǎn)品對(duì)控制動(dòng)物源性食品衛(wèi)生質(zhì)量、保障消費(fèi)者健康、保證工業(yè)生產(chǎn)等具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。本研究對(duì)青霉素類(lèi)藥物人工抗原的合成，動(dòng)物免疫以及ELISA檢測(cè)方法的建立等進(jìn)行了研究，得出如下研究結(jié)果： 選用半抗原氨芐青霉素、青霉素G與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)通過(guò)生理學(xué)法和戊二醛法合成3種免疫抗原，經(jīng)紫外、紅外掃描和蛋白電泳實(shí)驗(yàn)證明半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功，繼而用相同方法與載體蛋白卵白蛋白(OVA)合成了3種包被抗原。

3、 用合成的3種免疫抗原免疫9只新西蘭大白兔，在6次加強(qiáng)免疫后有8只兔子產(chǎn)生高效價(jià)多抗血清；通過(guò)3種包被抗原進(jìn)行多抗血清檢測(cè)，比較了各血清的效價(jià)和親和性，發(fā)現(xiàn)此兩種合成方法免疫兔子均能產(chǎn)生青霉素類(lèi)藥物核特異性抗體，在本實(shí)驗(yàn)中生理學(xué)法合成的免疫抗原免疫效果優(yōu)于戊二醛法合成法合成的，而同為生理學(xué)法合成的免疫抗原中，以氨芐青霉素為半抗原的免疫抗原效果略?xún)?yōu)于青霉素G的；并且選出多抗血清具有效價(jià)高、親和性好、核特異性的免疫兔子脾臟，用液氮妥善保存，

4、提供給合作單位以便與其共同制備單克隆抗體。 在前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，從合作單位獲得與本實(shí)驗(yàn)相符，通過(guò)生理學(xué)法免疫制備獲得的鼠單克隆抗體；同時(shí)，選擇相應(yīng)的包被抗原通過(guò)改良的過(guò)碘酸鈉法與辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)，用硫酸銨沉淀法純化，成功制備并獲得酶標(biāo)抗原。利用鼠單抗、包被抗原、酶標(biāo)二抗和鼠單抗、酶標(biāo)抗原分別建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法和直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法；并對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性半抗原進(jìn)行選擇性開(kāi)環(huán)處理，以提高鼠單抗的親和性；比較上述兩種EL

5、ISA檢測(cè)方法的靈敏度、線性范圍、線性擬合以及檢測(cè)步驟、檢測(cè)時(shí)間等因素，發(fā)現(xiàn)直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法靈敏度與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法相當(dāng)，而直接ELISA法檢測(cè)更為簡(jiǎn)便，較適合作為試劑盒產(chǎn)品的檢測(cè)方法。 本研究對(duì)直接ELLSA方法中的各檢測(cè)條件通過(guò)單因素顯著性分析和正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了比較，并確定底物溶液配方為10mLBuffer+450μLTMB+2μLH2O2，封閉液為5％甘氨酸，鼠單抗和酶標(biāo)抗原使用濃度分別為稀釋800倍和稀釋80倍，鼠

6、單抗包被條件為直接4℃冰箱放置過(guò)夜，封閉條件為37℃孵育2.5h，反應(yīng)條件為37℃孵育1.0h，顯色條件為37℃反應(yīng)10min，此時(shí)可達(dá)最佳顯色效果。用優(yōu)化后的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法測(cè)得青霉素類(lèi)藥物最低檢測(cè)限，其中氨芐青霉素1.58ng/mL，青霉素G0.38ng/mL，阿莫西林1.90ng/mL，氯唑西林0.13ng/mL，苯唑西林0.44ng/mL，均能達(dá)到食品中各青霉素類(lèi)藥物殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。 整個(gè)試劑盒實(shí)際檢測(cè)操作時(shí)間在

7、1.5h以?xún)?nèi)；以青霉素G為對(duì)照物，通過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值，給出緩沖溶液條件下推薦的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為Y=0.327X+0.2419，X為log(青霉素濃度ng/mL)，Y為抑制率，最低檢測(cè)限0.368ng/mL，檢測(cè)范圍0.5～100ng/mL，尿樣和牛奶樣品稀釋10倍后檢測(cè)可參照此標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)樣品回收率在70～120％之間。由于青霉素類(lèi)藥物在奶制品中殘留的嚴(yán)重現(xiàn)象，針對(duì)牛奶特殊樣品，用10％脫脂奶粉溶液做牛奶基質(zhì)，得到以牛奶為